Possible role of adenine and thymine rich sequence in the encapsidation pattern of Parvovirus LuIII

Abstract

LuIII is a small, non-enveloped, icosahedral autonomous parvovirus that contains a small linear (5 kb) single stranded DNA genome and infects human cell lines lytically with no evidence of integration into cellular DNA. This parvovirus has been considered as an appropriate vector where only transient expression of a transduced gene is desired. Comparison of the LuIII sequence with those of rodent parvoviruses, minute virus of mice (MVM) and H-1 revealed that these viruses are virtually identical with respect to their genomic organization and share 80% sequence homology. However there is a 47 bp AT-rich region starting at nucleotide position 4558 that is unique to LuIII. Previous studies postulated that this AT-rich region is responsible for the symmetric encapsidation of plus and minus strand genomes by LuIII since both MVM and H-1 encapsidate primarily minus strand. To address this hypothesis, two recombinant LuIII genomes lacking the AT-rich sequence, termed pGlu883DXbaA/T- and pGlu883DXbaA/T- de novo, were transfected into HeLa cells. Southern blot analysis and probe hybridization revealed that both pGlu883DXbaA/T- constructs are unable to replicate. Cotransfection assays with LuIII minigenomes and a helper construct containing the nonstructural protein NSI under the CMV promoter (pCMVNSI) resulted in similar findings as the transfections. Thus, it is possible that the AT-rich region is a cis-acting sequence required for LuIII DNA replication.

LuIII es un parvovirus autónomo, icosahedral y desnudo que contiene un genoma pequeño (5 kb) de DNA de cadena sencilla. Este virus infecta líticamente varias líneas celulares sin evidencia de integración en el DNA genómico. LuIII ha sido considerado como un vector adecuado cuando sólo se desea la expresión transitoria de los genes transfectados. La comparación entre las secuencias de los virus LuIII, los parvovirus de roedores, el “minute virus of mice” (MVM) y el virus H-1 revelan que estos virus son virtualmente idénticos con respecto a su organización genómica, y que comparten el 80% de homología en las secuencias de DNA. Sin embargo, LuIII tiene una región única de 47 pb la cual es rica en AT a partir del nucleótido 4558. Estudios anteriores han postulado que esta región es responsable de la encapsidación simétrica de los genomas con sentido positivo y negativo de LuIII; debido a que tanto el MVM y el H-1, que no tienen la región rica en ATs, encapsidan principalmente la cadena negativa. Para comprobar esta hipótesis, dos genomas recombinantes de LuIII sin la secuencia rica en ATs, llamados pGlu883DXbaA/T- y pGlu883DXbaA/T- de novo, fueron transfectados en células HeLa. Los análisis de Southern blot e hibridación de sondas revelaron que ambas construcciones LuIIIAT- son incapaces de replicarse. Ensayos de cotransfección con los minigenomas de LuIII y una construcción auxiliar que contiene la proteína no estructural NS1 bajo el promotor CMV (pCMVNSI) produjeron resultados similares a los de las transfecciones. Es posible que la secuencia rica en AT sea un elemento de acción cis necesario para que ocurra la replicación del genoma de LuIII.