Chromosomal rearrangements of Psittacidae evolution: zoo-fish in Amazona vittata and in silico analysis of chromosomal rearrangements validated by de novo PCR

Abstract

The Puerto Rican parrot (Amazona vittata, AVI) is a critically endangered species and the only native parrot species remaining on all U.S. territories. After its genome was sequenced through a community-funded project, we studied the ALLPATH 2012 genome assembly largest 3,099 scaffolds using UCSC Genome Browser’s BLAT tool against the chicken reference genome. The alignments of the first and last 25 kb of the scaffolds showed a total of 164 possible chromosomal rearrangements. A selection of the alignments with scores greater than 1,000 on both sides was made and primers were designed from the rearrangement joint regions. Out of the 19 putative rearrangements that did not involve sexual or unknown chromosomes, five were confirmed as true rearrangements in four Amazon parrots, including the Puerto Rican parrot. With our de novo PCR validation approach, we also confirmed that three of these rearrangements occurred before the evolutionary split of the African grey parrot, joining chicken chromosomes 2 with 15, 6 with 7, and 8 with 9. PCR further showed that the remainder two chromosomal rearrangements, joining chicken chromosomes 3 with 9 and 6 with 7, occurred after the split of the scarlet macaw. In order to revalidate these rearrangements, we used the well-established Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) technique, hybridizing 10 chicken (GGA) whole-chromosome paints on Puerto Rican parrot metaphases. The FISH revealed three [6 with 7 (2) and 8 with 9] of the previously confirmed rearrangements through PCR and the rest of the chicken paints hybridized to unique segments or whole chromosomes in the parrot. Chicken chromosome probe 1 gave a signal on AVI3, GGA2 on AVI2 and a pair of microchromosomes, GGA3 on AVI1, GGA4 on AVI4 and to an arm of the metacentric AVI8, while GGA5 painted AVI7, GGA6 & 7 interestingly painted AVI6 in an alternated fashion, and GGA8 and 9 shared hybridization signals on a microchromosome pair. Furthermore, GGA9 also painted AVI9 and GGAZ painted its equivalent Z chromosome in the parrot. In addition, 100 of these metaphases were also used to describe A. vittata’s karyotype, which averaged a chromosome diploid number of 76. All together, these results contribute as the first complete description of the karyotype evolution of an Amazon species.

La cotorra puertorriqueña (Amazona vittata, AVI) es la única especie nativa en todos los territorios de los Estados Unidos y actualmente se encuentra en crítico riesgo de extinción. Luego de que su genoma fuese secuenciado, como parte de un proyecto subsidiado por la comunidad; nos dimos a la tarea de estudiar los 3,099 andamios más grande de su ensamblaje de ALLPATH del 2012, alineándolos contra el genoma de la gallina como referencia, mediante el uso de la herramienta de “BLAT” en el “UCSC Genome Browser”. Los alineamientos de las primeras y últimas 25 kb de los andamios resultaron en un total de 164 posibles rearreglos cromosómicos. Se realizó una selección de los alineamientos con puntajes mayores a 1,000 en ambas puntas y se diseñaron cebadores a partir de la región donde se encontraba cada rearreglo aparente. De un total de 19 potenciales rearreglos cromosómicos que no incluían cromosomas sexuales ni tampoco cromosomas desconocidos, cinco rearreglos fueron confirmados en todas las cuatro especies de cotorras amazonas estudiadas, incluyendo la cotorra puertorriqueña. Mediante nuestro enfoque de PCR de novo para rearreglos cromosómicos, también se confirmó que tres de estos rearreglos ocurrieron antes de la divergencia del loro gris (Psittacus erithacus), uniendo así los cromosomas análogos en la gallina número 2 con el 15, el 6 con el 7 y el 8 con el 9. El PCR en adición probó que los dos rearreglos restantes, del cromosoma 3 con el 9 y otro del 6 con el 7, ocurrieron después de la divergencia evolutiva del guacamayo macaco (Ara macaco). Con el fin de revalidar estos rearreglos, utilizamos la muy conocida técnica de Hibridación Fluorescente In Situ o FISH por sus siglas en inglés, hibridando unas 10 sondas de cromosomas completos de la gallina (GGA) con los cromosomas de la cotorra puertorriqueña. La técnica reveló tres de los rearreglos previamente confirmados por PCR [6 con el 7 (2) y el 8 con el 9] y el resto de las sondas hibridó un único segmento o a un cromosoma en su totalidad en la cotorra. La sonda perteneciente al cromosoma 1 en la gallina mostró señal en el AVI3, el GGA2 en el AVI2 y en un par de cromosomas indistinguibles o microcromosomas, el GGA3 en el AVI1, el GGA4 en el AVI4 y en uno de los brazos del cromosoma metacéntrico AVI8. A su vez, el GGA5 hibridó en el AVI7, y el GGA6 y 7 hibridaron ambos en el mismo cromosoma AVI6 de una forma alternada, mientras que el GGA8 y 9 compartieron señales en un par de microcromosomas, aunque el GGA9 también dio señal en el cromosoma AVI9 completo. Finalmente, GGAZ pintó a su equivalente Z en la cotorra. Mas aún, 100 de las metafases de la cotorra se utilizaron a su vez para describir el cariotipo de A. vittata por primera vez, resultando en un promedio de número de cromosomas diploides de 76. Todo el trabajo en conjunto representa el primer estudio descriptivo completado del la evolución del cariotipo de una especie de cotorra amazona.