The role of position E11 in the stabilization of the HbI-SH2 complex from L. pectinata

Abstract

The bivalve mollusk, Lucina pectinata, contains three hemoglobins: hemoglobin I (HbI) which is a H2S reactive protein, hemoglobin II (HbII) and hemoglobin III (HbIII) which deliver O2 to the organism. HbI is a monomeric protein that contains an unusual distal pocket characterized by the presence of a GlnE7 and aromatic residues PheB10 PheE11and PheCD1 that stabilize ligands such as H2S. Substitution of the GlnE7 residue by Val, Asp, His and PheB10 by Leu or Tyr demonstrated that both residues at the E7 and B10 positions are crucial for the H2S reactivity towards HbI. Mutations at the position E11 by Val, Tyr and Gln residues in presence of H2S ligand were analyzed to determine the association rate constant value (kon) and the dissociation rate constant value (koff), respectively. To determine the association and dissociation rate constants two different techniques were used: (i) Stopped flow (association rate constants) and (ii) UVVIS spectrophotometry (dissociation rate constants). The values obtained for the association constant values for the PheE11 substitution for Val, Tyr and Gln were 1.33 x 104 M-1 s -1, 1.04 x 104 M-1 s -1 and 2.6 x 104 M-1 s -1, respectively. Dissociation rate constants obtained for the Val, Tyr and Gln substitution were 3.199 x 10-5 s -1, 1.683 x 10-5 s -1 and 9.2 x 10-5 s -1, respectively. Results demonstrated that PheE11 is not a gate pathway for entrance or exit of the H2S ligand. However, this position influences synergistically the role of other heme pocket amino acids such as GlnE7 and PheB10, to move towards or away the ligand-binding site. Data also suggests that E11 position has no a direct influence in the heme-ligand association constant while indirectly affects the heme-ligand dissociation constant.

El molusco bivalvo, Lucina pectinata, contiene tres hemoglobinas: hemoglobina I (HbI) la cual es una proteína reactiva al acido sulfhídrico (H2S), la hemoglobina II (HbII) y hemoglobina III (HbIII) la cual libera oxígeno al organismo. HbI es una proteína monomérica que contiene una región distal caracterizada por la presencia de GlnE7 y los residuos aromáticos PheB10, PheE11 y PheCD1, los cuales estabilizan ligandos como H2S. La sustitución de GlnE7 por Val, Asp e His y PheB10 por Leu o Tyr demuestra que ambas posiciones son cruciales para la reactividad de H2S con HbI. La mutación en la posición E11 por los residuos Val, Tyr y Gln en presencia del ligando H2S fueron analizados para determinar la constante de asociación (kon) y disociación (koff), respectivamente. Para determinar las constantes de asociación (kon) y disociación (koff) se utilizaron dos técnicas: (i) Stopped flow (constante de asociación) y (ii) Espectrofotometría UV-Vis (constante de disociación). Los valores de las constantes de asociación obtenidas para la sustitución de PheE11 por Val, Tyr y Gln fueron 1.33 x 104 M -1 s -1, 1.04 x 104 M-1 s -1 y 2.6 x 104 M-1 s -1, respectivamente. Los valores de las constantes de disociación obtenidas para Val, Tyr y Gln fueron 3.199 x 10-5 s -1, 1.683 x 10-5 s -1 y 9.2 x 10-5 s -1, respectivamente. Estos resultados demuestran que la posición E11 no es una vía de entrada o salida del H2S. Sin embargo, esta posición influye sinergéticamente a los amino ácidos que se encuentran en la región distal del grupo hemo como PheB10 y GlnE7, haciendo que estos se acerquen o alejen del sitio de enlace del ligando. Los datos también sugieren que la posición E11 no tiene una influencia directa en la constante de asociación pero sí tiene una influencia indirecta en la constante de disociación.