Methemoglobin I from lucina pectinata: A feasible alternative for a prototype biosensor for hydrogen sulfide

Abstract

Hydrogen sulfide (H2S) is one spiteful smelling gas that was considered for centuries extremely noxious to biological species. However, the fact that three enzymes endogenously catalyze H2S synthesis and that it has been detected in our body has changed dramatically our perceptions about H2S. The duality of this gas, its positives or negative biological effects, is responsible for the great interest of the scientific community to measure with high precision and accuracy H2S levels in biological fluids. In spite of multiple efforts as well as great number of analytical techniques, the accurate real-time H2S measurements in the nano to micromolar range will be a challenge. Thus, the search of a new, tough and precise sensor for H2S detection and analysis is one of the most important research areas in this new scientific community. Hemoglobin I from Luciana pectinata has the unique characteristic of binding and transporting H2S to symbiotic bacteria. Their high affinities toward H2S-binding suggest that this hemoprotein can be used to detect this physiologically relevant signaling molecule. Thus, recombinant hemoglobin I (r-HbI) immobilized in a conductive and biocompatible surface like multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) will be a suitable model to develop a unique biosensor for H2S. Analysis of each step of the MWCNTs modification is fundamental to achieve the adequate development of the H2S biosensor. Therefore, the optimal conditions to immobilize the r-Hb at the MWCNTs are the primary focus of the first part of this work. Functionalization with a biocomponent (i.e., Histidine or Lysine residue or (His)6-tagged rHbI) was first achieved by the carboxylation of MWCNTs followed by amidation with the desired species. The resulting interactions (covalent or non-covalent) were then analyzed and characterized using spectroscopy techniques. The results showed that both Histidine and Lysine amino acids were immobilized on the MWCNTs by amide bond, but the r- HbI can only interact by non-covalent interactions. Thus, the covalent immobilization of the rHbI to the MWCNTs was achieved through another route. First the section coding for the histidine-tag was removed from the cloning vector, the coding region for HbI was modified to include lysine residues at the C-terminus, followed by directional cloning into the pET28(a+) vector. In the second part of this work a poly-Lys tag was fused to Lucina pectinata’s hemoglobin I (HbI) coding sequence to immobilize the protein on a conductive and biocompatible surface for H2S detection. The (Lys)6-tagged rHbI construct was expressed in E. coli and purified by immobilization on a cation exchange matrix, followed by size exclusion chromatography. The identity, structure and function of the (Lys)6-tagged rHbI was also assessed by mass spectrometry, small and wide X-ray scattering, optical spectroscopy and kinetic analysis. The scattering, spectroscopic and kinetic results showed that the (Lys)6-tagged rHbI is structurally and functionally analogous to the native and the (His)6-tagged proteins. A high value of the association rate constant (Kon 1.4 x 105 M-1 s-1) and low value of its dissociation constant (koff 0.1 x 10-3 s-1) evidences this. This results confirmed that the (Lys)6-tagged rHbI binds H2S with the same high affinity as its homologue. The third and last part of this research focused in achieved an orientate and covalent immobilization on a conductive surface without the loss of its particular function to bind H2S at its active center as well demonstrating that (Lys)6-tagged rHbI/MWCNTs biocomposite is electrochemically active and it could be using as a long term possible bio-probe for H2S detection. Therefore, using a coupling agent, approximately 27% of the (Lys)6-tagged rHbI was immobilized via a peptide bond on to carbonyl-oxidized carbon nanotubes transducer surfaces, i.e., powder and verticallyaligned carbon nanotubes (VACNTs). The immobilization was achieved by following two steps: 1) generation of amine-reactive ester from the carboxylic acid groups of the surfaces and 2) coupling these groups with the amine groups of the Lys-tag in the (Lys)-tag rHbI moiety. We analyzed the immobilization process using different conditions and techniques to differentiate protein covalent attachment from physical adsorption. Fourier transform infrared (FTIR) microspectroscopy data showed a 14 cm-1 displacement of the protein’s amide I and amide II peaks to lower frequency after immobilization. This result indicates a covalent attachment of the protein to the surface. Differences in morphology of the carbon substrate with and without (Lys)6- tagged rHbI confirmed protein immobilization, as observed by transmission electron microscopy (TEM), supporting the FTIR findings. Electrochemical analysis also demonstrated the immobilization of the (Lys)6-tagged rHbI at the VACNTs electrode and its redox potential Ep= (-0.18 ?? 0.03)V. (Lys)6-tagged rHbI/VACNTs response toward H2S was evaluated. The results suggest the potential applicability of this electrode to detect H2S.

Sulfuro de hidrógeno (H2S) es un gas maloliente que durante siglos se consideró como uno gas extremadamente nocivo para las especies biológicas. Sin embargo el hecho que tres enzimas catalicen endógenamente su síntesis en el cuerpo humano, han cambiado dramáticamente la percepción que se tenía sobre H2S. La dualidad que exhibe este gas, con efectos biológicos tanto positivos como negativos ha provocado un gran interés en la comunidad científica por lograr medir con precisión y exactitud sus niveles en fluidos biológicos. A pesar de la gran cantidad de esfuerzos y del sin número de técnicas analíticas, todavía continúa siendo un reto el poder medir con exactitud y en tiempo real concentraciones de H2S en el rango de micro a nanomolar. Esto ha generado que la búsqueda por un nuevo método, robusto y preciso para la detección y análisis de H2S sea una de las áreas de investigación más importantes para esta nueva comunidad científica enfocada en las investigaciones sobre H2S. La Hemoglobina I (HbI) proveniente de la almeja Lucina pectinata es una hemoproteína cuya particularidad es enlazar y transportar H2S hacia la bacteria con quien vive en simbiosis. La alta afinidad para enlazar H2S en su centro activo sugiere que esta hemoproteína podría ser utilizada para detectar esta molécula de señalización, y/o de gran relevancia fisiológica. Por tanto, si la hemoglobina I recombinada (rHbI) es inmovilizada sobre una superficie conductora, biocompatible como lo son los nanotubos de carbono de pared múltiple (MWCNTs por sus siglas en inglés) se tendría un modelo idóneo para el desarrollo de un biosensor selectivo para H2S. El análisis de cada paso para la modificación de los MWCNTs con la rHbI es fundamental para lograr el desarrollo adecuado de un biosensor para H2S. Es por esto, que el enfoque de la primera parte de este trabajo de investigación fue el determinar las condiciones óptimas para la inmovilización de la rHbI sobre la superficie de los MWCNTs. Con este propósito inicialmente se evaluó la funcionalización de los MWCNTs con un biocomponente ( e.g. Histidina (His), Lysina (Lys) o (His)6-tagged rHbI). La interacción resultante (covalente o no-covalente) fue analizada y caracterizada mediante el uso de técnicas espectroscópicas. Los resultados mostraron que tanto el amino ácido de Histidina como el de Lysina fueron inmovilizados covalentemente en la superficie de los MWCNTs a través de la formación de un enlace amida. Sin embargo las interacciones encontradas con la (His)6-tagged rHbI fueron de tipo nocovalente. Lo que sugirió que para lograr la inmovilización covalente de la rHbI a los MWCNTs había que utilizar otra ruta. Esta nueva ruta involucró en primera instancia le remoción de la sección que codifica para la etiqueta (tag) de poli-Histidina en el vector de clonaje; además de que se modificó la región de DNA que codifica para rHbI con los nucleótidos necesarios para la incorporación de seis residuos de Lysina en el terminal-C de la proteína. Esto seguido por la clonación direccional en el vector pET28(a+). En la segunda parte del trabajo a la recombinada de HbI (rHbI) se le fusionó una etiqueta de poli-Lysinas que pudiera ser utilizada en la inmovilización covalente de la proteína sobre una superficie conductora, biocompatible. El constructo para la (Lys)6-tagged rHbI fue expresado en E. coli y purificado mediante cromatografía de intercambio catiónico utilizando el Lys-tag y seguido de un segundo proceso cromatográfíco de exclusión por tamaño. La identidad, estructura y funcionalidad de la (Lys)6-tagged rHbI fue evaluada mediante espectrometría de masa, dispersión de rayos-X a ángulos pequeños y amplios, espectroscopia óptica y análisis cinético. Los resultados espectroscópicos y cinéticos demostraron que la (Lys)6-tagged rHbI es estructural y funcionalmente análoga a la hemoglobina nativa o a la recombinada con His, (His)6-tagged rHbI. Evidencia concluyente de esto es su constante de rapidez de asociación (Kon 1.4 x 105 M-1 s-1) de gran magnitud mientras su constante de disociación (koff 0.1 x 10-3 s-1) es una pequeña. Estos resultados confirmaron que la (Lys)6-tagged rHbI enlaza H2S con la misma alta afinidad con la que lo hace la especie homologa. La tercera y última parte de esta investigación estuvo enfocada en lograr la inmovilización de la hemoproteína sobre una superficie conductora en forma covalente y orientada, y sin la perdida de su función, de enlazar H2S. Igualmente, esta parte se dirigió en demostrar que este biocomposito, (Lys)6-tagged rHbI/MWCNTs es electroquímicamente activo y es una alternativa viable a largo plazo para la detección de H2S. Para la realización de lo antes mencionado fue necesario la utilización de agentes acoplantes, que permitieron el inmovilizar aproximadamente un 27 % de (Lys)6-tagged rHbI a través de la formación de un enlace amida entre los grupos aminos de la cadena lateral del Lys-tagged en la proteína y los carbonilos en la superficie oxidada de los nanotubos de carbono utilizados; eg. nanotubos en polvo y los electrodos de nanotubos de carbono verticalmente alineados (VACNTs). Esta inmovilización se logró utilizando un proceso de dos pasos consecutivos: 1) la generación de una especie reactiva de amina a partir de los grupos carboxílicos en la superficie de los CNTs, seguido por 2) el acoplamiento de estos grupos con los grupos aminos del Lys-tag en la (Lys)6-tagged rHbI. Para poder estudiar y caracterizar el proceso de inmovilización se utilizaron diferentes condiciones y diferentes técnicas de análisis que permitieran distinguir entre un proceso de físico-adsorción versus uno covalente. Un desplazamiento de 14 cm-1, hacia frecuencia menores en los picos de infrarrojo (IR) correspondientes a la amida I, y la amida II, luego de la hemoproteina haber sido inmovilizada sobre la superficie oxidada de los MWCNTs, fueron evidencia de una inmovilización a través de la formación de un enlace covalente. Las imágenes de microscopia de transmisión de electrones (TEM) antes y después de la inmovilización (Lys)6-tagged rHbI mostraron cambios en la morfología de las paredes laterales de los MWCNTs indicativos de la inmovilización covalente, estos resultados sustentaron los ya obtenidos por IR. Los análisis electroquímicos también demostraron la inmovilización de (Lys)6- tagged rHbI en los VACNTs, además de su potencial redox (Ep= -0.18 ± 0.03)V. Se analizó la respuesta de (Lys)6-tagged rHbI/VACNTs hacia la adición de diferentes concentraciones de H2S y los resultados sugieren que este biocomposito, (Lys)6-tagged rHbI/MWCNTs es un bio-electrodo robusto que pudiera ser utilizado para la detección de H2S.