Protein denaturation during magnetic fluid hyperthermia at a constant thermal dose

Abstract

Although the exact pathways leading to cell killing during hyperthermia are still not fully understood, it appears that protein denaturation is crucial in such process. To determine if the manner in which the magnetic field is applied has an effect on the amount of protein denaturation induced, three different magnetic field profiles were applied during Magnetic Fluid Hyperthermia (MFH) with equivalent thermal dose or Cumulative Equivalent Minutes under a reference temperature of 43oC (CEM43oC). Conformational changes induced by thermal denaturation of Bovine serum albumin (BSA) protein were monitored by changes in fluorescence of 8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid (1,8-ANS) bound to the protein's hydrophobic sites. Iron oxide nanoparticles coated with covalently attached carboxymethyl-dextran (IO-covCMDx) were added to samples at a concentration of 0.6 mg IO core/ml. MFH under the different conditions and hot water hyperthermia (HWH) were applied to ANS-BSA samples until an equivalent thermal dose of 60 CEM43oC was achieved. For MFH, average induction heater power values of 44% (average magnetic field intensity of H = 40.5 kA/m) for TSP = 43oC and 55% (average magnetic field intensity of H = 45.7 kA/m) for TSP = 45oC were used, with the following schedules: constant power, and three different square waveforms with high power level working cycles of A - 67%, B - 33%, and C - 50%. ANS-BSA exposed to MFH at 43oC exhibited greater denaturation than standard HWH treatment under equal temperature set points and CEM43oC of 60 minutes. Moreover, for a temperature set point of 45oC and equal CEM43oC, fluorescence recovery of ANS-BSA observed between MFH and HWH showed similar behavior to the temperature set point of 43oC. Between the different MFH conditions applied, results showed statistically similar denaturation was achieved using constant power versus Condition A, whereas Condition B achieved greater denaturation than the previous two conditions. For Condition C, denaturation achieved was similar to that under Condition A, for both temperature set points. Importantly, the results demonstrate that under same conditions of CEM43°C MFH results in greater irreversible protein denaturation, compared to HWH. Furthermore, the results demonstrate that even under conditions of equal average power and equal medium temperature, alternating magnetic field working cycles with higher power application result in greater irreversible protein denaturation contrary to expectations based on continuum heat transfer arguments. However as the heat dissipation rate for IO-covCMDx does not increase linearly with magnetic field intensity, the average SAR values applied for higher power values were not equivalent during all conditions even though average power was used.

Aún cuando se desconocen con exactitud los mecanismos que conducen a la muerte celular durante hipertermia, al parecer la desnaturalización de sus proteínas es crucial en este proceso. Para determinar si la manera en que el campo magnético es aplicado tiene un efecto en el grado de desnaturalización de proteína inducido, tres distintos perfiles de campo magnético se aplicaron durante Hipertermia usando Fluidos Magnéticos (MFH), usando una dosis termal equivalente o Minutos Equivalentes Cumulativos a una temperatura de referencia de 43oC (CEM43oC). Cambios conformacionales inducidos por la desnaturalización termal de albúmina de suero bovino (BSA) se observaron mediante cambios en fluorescencia de 1,8-ANS enlazados a los grupos hidrofóbicos de la proteína. A las muestras se le añadieron nanopartículas de óxido de hierro, cubiertas con CMDx covalentemente enlazado a su superficie, a una concentración de 0.6 mg/ml. A las muestras de ANS-BSA se les aplicó MFH bajo las diferentes condiciones así como hipertermia usando un baño de agua caliente (HWH), hasta alcanzar una dosis termal equivalente de CEM43oC igual a 60 minutos. Para MFH, se utilizaron los siguientes valores de potencial promedio: 44% (intensidad de campo magnético promedio de H = 40.5 kA/m) para una temperatura de TSP = 43oC y 55% (intensidad de campo magnético promedio de H = 45.7 kA/m) para TSP = 45oC, con los siguientes perfiles: potencia constante, y tres perfiles de onda cuadrada con ciclo de trabajo A - 67%, B - 33%, and C - 50%. Muestras de ANS-BSA expuestas a MFH a 43oC mostraron mayor desnaturalización que durante tratamiento con HWH bajo las mismas condiciones de temperatura y CEM43oC de 60 minutos. Para una temperatura de 45oC y CEM43oC equivalentes, se observó que el porcentaje de fluorescencia recuperado fue similar que para el caso a 43oC. Entre las diferentes condiciones de MFH aplicadas, se obtuvieron resultados estadísticamente similares utilizando potencia constante versus la Condición A, mientras que la Condición B logró mayor desnaturalización que las dos previas condiciones. Para MFH bajo la Condición C, la desnaturalización que alcanzó la muestra fue similar a los resultados obtenidos durante aplicación de la Condición A para ambas temperaturas. Los resultados muestran que bajo condiciones equivalentes de CEM43°C, MFH resultó en mayor desnaturalización irreversible en comparación a HWH. Más aún, los resultados demostraron que aún bajo condiciones de potencia promedio y temperatura equivalentes, campos magnéticos alternantes con mayores potencias aplicadas resultaron en mayor desnaturalización irreversible contrario a lo esperado en base a argumentos sobre continuidad de transferencia de calor. Sin embargo, dado a que la capacidad de disipación de calor para las nanopartículas de IO- covCMDx no incrementa linealmente con intensidad de campo magnético, el SAR promedio aplicado a potencias mayores no fue equivalente bajo iguales condiciones de potencia promedio.