Characterization of novel cassava genes involved in cyanide detoxification, β-cyanoalanine synthase and cysteine synthase, using Arabidopsis thaliana mutants

Abstract

Cassava (Manihot esculenta crantz) is a perennial shrub of the family Euphorbiaceae and is one of the most important foods in the world. As a subsistence crop, it is highly competitive due to its advantages in production such as high yields per hectare. Cassava can be easily cultivated and is tolerant to extreme stress conditions such as drought. It is propagated very easily as cuttings with up to 20 cuttings being obtained from one plant. Its tuberous roots are rich in starch, being an excellent source of calories for humans. Besides the advantages of cassava, it contains high amounts of cyanogenic glycosides, which are compounds that yield free cyanide. The cyanogenic glycoside of major abundance in cassava is linamarin, which is synthesized from valine in reactions that occur in the vacuole of the plant cell. Linamarin can be hydrolyzed by the cell wall associated linamarase, especially when there is tissue rupture, producing acetone cyanohydrin. Therefore, poorly processed cassava roots will accumulates toxic levels of acetone cyanohydrin, which can cause cyanide associated health problems such as Konzo, Tropical Ataxic Neuropathy and Goitre. Despite the fact that cassava has a cyanide detoxification pathway, it is not enough for the removal of all the cyanide in some varieties. Recently, two genes from the cassava detoxification pathway, MANes;BsasA and MANes;BsasB, where isolated and based on enzyme assays MANes;BsasB may be involved directly in the cyanide detoxification pathway and MANes;BsasA in cysteine biosynthesis, which is also important in the cyanide detoxification pathway. Prior to utilizing these novel genes for genetic transformation of cassava they have been studied using mutants of the model plant Arabidopsis thaliana. Mutants have target genes in the cyanide detoxification pathway silenced thus enabling the functional complementation with the novel cassava genes. Two different expression vectors (pKYLX and pB2GW7) were used in this study for the transformation of the plants with Agrobacterium tumefaciens. The floral dipping method was performed using many modifications since false positive transgenics were obtained in multiple experiments. However, the selection protocol employed was unable to confirm transgenic lines with the T-DNA integrated into its genome. It is believed that the concentration of the surfactant Silwet L-77 that was used for the transformation protocol could have interfered with the transformation mechanism. The plant stage can also be a factor for the lack of transgenic plants due to the importance of the right flowering stage in the floral dipping method. It is also possible that a mutation in any of the virulence genes from Agrobacterium resulted in no T-DNA transfer due to the importance of the virulence genes in this process. Furthermore, mutations or gene rearrangements in areas like the selectable marker or its promoter, or the T-DNA borders, could also affect the integration of the T-DNA into the plant genome. Detailed sequencing of the T-DNA region could be employed to verify that there are no mutations.

La yuca es un arbusto perenne de la familia Euphorbiaceae y es uno de los cultivos más importantes del mundo. Este cultivo de subsistencia es altamente competitivo debido a sus ventajas en producción, como por ejemplo su alta producción por hectárea y su flexibilidad en cuanto a su sembradía y cosecha. La yuca es fácilmente cultivada y es tolerante a condiciones extremas como la sequía. La misma puede ser propagada fácilmente con estacas, obteniendo unas 20 estacas por planta. Sus raíces son ricas en almidón, lo que la hace una excelente fuente de calorías para los humanos. A pesar de todas las ventajas que posee la yuca esta contiene cantidades altas de glucósidos cianogénicos, los cuales son compuestos que producen cianuro. El glucósido cianogénico de mayor abundancia en la yuca es linamarina, el cual es sintetizado en reacciones que ocurren en la vacuola de la célula. Linamarina puede ser hidrolizada por la enzima linamarasa, la cual se encuentra en la pared celular y entra en contacto con la linamarina, especialmente cuanto hay rompimiento del tejido, produciendo así cianuro. Por lo tanto, si la yuca no es procesada correctamente puede acumular niveles tóxicos de cianuro que pueden ser responsables de condiciones de la salud como ―Konzo‖, ―Tropical Ataxic Neurophaty (TAN)‖ y ―Goitre‖. A pesar de que la yuca está equipada con un mecanismo para eliminar el cianuro, el mismo no es suficiente para remover los niveles tóxicos de cianuro en algunas variedades. Recientemente se aislaron dos genes de yuca que están envueltos en el proceso de detoxificación de cianuro, MANes;BsasA y MANes;BsasB. Según los ensayos enzimáticos realizados se cree que MANes;BsasB funciona directamente en la detoxificación de cianuro, mientras que MANes;BsasA funciona principalmente en la formación de cisteína. Antes de utilizar los genes para la transformación genética de yuca, los mismos han sido estudiados utilizando mutantes de la planta modelo Arabidopsis thaliana. Los mutantes tienen genes del proceso de detoxificación de cianuro silenciados, permitiendo la caracterización de los genes de yuca. En este estudio se utilizaron dos vectores de expresión (pKYLX y pB2GW7) para transformar Arabidopsis con Agrobacterium tumefaciens. Se utilizó el método de transformación conocido como ―floral dipping‖, pero no fue posible confirmar plantas transgénicas mediante nuestro protocolo de selección. Es posible que la concentración del detergente Silwet L-77, el cual es importante en la transformación debido a que remueve la tensión superficial y permite que la bacteria pueda penetrar fácilmente el tejido para la infección, haya interferido con el proceso. Otras posibles explicaciones son la edad de las plantas al momento de transformarse o que la solución de Agrobacterium con Silwet L-77 no se haya escurrido lo suficiente, provocando daños al tejido. También es posible que una mutación en alguno de los genes de virulencia de Agrobacterium resultara en un mecanismo de inserción del ADN defectuoso. Por otro lado, mutaciones o desplazamientos de los genes en otras partes de los vectores pudieron haber afectado la transferencia de nuestros genes de interés al genoma de la planta. En una próxima ocasión sería necesario secuenciar todos esos componentes para verificar que no hay mutaciones.