Effects of apoptotic inhibitor addition to cell viability prolongation of suspended bench-scale CHO culture and analysis of raman spectra in off-line bioreactor samples

Abstract

The productivity of suspended mammalian cell cultures plays a major role in the overall manufacturing costs of biotechnology products. Upstream cell culture product variability can lead to problems in downstream purification and even in the quality of the final product. Amino acids and carbohydrates are the major raw substrates of mammalian cell metabolism. Knowing the ways in which the cells use these nutrients, researchers can gain a better understanding of what factors contribute to productivity, variability and apoptosis in cell culture processes. To achieve this knowledge, Raman spectroscopy can be used to develop a non-invasive, in-line tool to monitor and better understand the mammalian cell growth process in real-time. Our work is focused in implementing this analytical method as a way to monitor off-line cell metabolism and death under different culture conditions, such as two levels of temperature set points and presence or absence in the culture medium of an apoptosis inhibitor (Cytochrome C inhibitor). Techniques such as HPLC and biochemical analyzers were used as reference methods to validate the Raman spectra as a routine measurement in suspended mammalian cell culture processes and to monitor metabolic pathway changes. It is expected that the implementation of this methodology in-line will result in a better comprehension of mammalian cell culture in real-time and an improvement of productivity in such systems, as well as a tool towards implementation of process analytical technologies (PAT). Eight batches of suspended cultures of Chinese hamster ovary (CHO) cells were performed under four different conditions. The best parameters were a temperature shift of 35-33°C in 2.5 days with addition in the media of the apoptotic inhibitor (Cytochrome C inhibitor). In this case, twelve run days were achieved with viability between ninety and eighty percent with a substantial increment in L-lactate of approximately 35% as a secondary metabolite and a constant cell density on the entire runs. In addition to this condition a cell viability decay rate was observed. For conditions with temperature shift of 37-33°C in 2.5 days and overexpression or addition of the anti-apoptotic molecule, data obtained show that even though a higher viability was achieved, the run days could not be extended, an increment of approximately 35% on L-lactate production was also observed and the cell density decay rate was faster. This increment shows the possibility of double inhibition by the over-expression of the apoptotic inhibitor. As a consequence, these simultaneous inhibitions affect the cell metabolism and avoid the normal process of gluconeogenesis as published by Centocor with the use of another apoptotic inhibitor. These present increments on L-lactate provoke the use of more base in the process to stabilize and maintain pH measurements among the runs showing increments in osmolality values too. The proposed use of Raman to monitor cell metabolism and apoptosis was assayed in an offline mode providing promising results for cell metabolism monitoring (secondary and primary metabolites). The case of cell viability identification is still a matter of study. Peaks of some intracellular components were identified and they would constitute a subject of study to model any increase that could be associated with cellular survival or death.

La productividad de los cultivos suspendidos de células mamíferas juega un rol importante en el costo de la manufactura de productos biotecnológicos. La variabilidad en esta parte del proceso puede propiciar problemas en etapas subsiguientes, como lo es las purificación; provocando posibles cambios negativos en la calidad del producto final. Amino ácidos y carbohidratos son la mayor fuente principal de substratos en el metabolismo celular de un mamífero. Comprendiendo las maneras en que las células utilizan estos nutrientes los investigadores pueden obtener una mayor comprensión de que factores contribuyen a la productividad, variabilidad y la apoptosis en los cultivos celulares. Para alcanzar este entendimiento, la espectroscopía Raman puede ser utilizada para desarrollar una herramienta no invasiva en línea para monitorear y comprender mayor el crecimiento celular mamífero en tiempo real. Nuestro trabajo se enfoca en implementar este método analítico como una manera de monitorear fuera del cultivo (off-line) el metabolismo celular y la muerte celular bajo diferentes condiciones operacionales en el cultivo. Dos parámetros con dos niveles cada uno fueron estudiados. Rangos de temperatura entre 35-33° C y 37-33 °C y la presencia de el inhibidor de apoptosis (inhibidor de citocromo C) en el medio. Técnicas tales como el HPLC y analizadores bioquímicos fueron usados como métodos de referencia para validar los espectros de Raman obtenidos para ser usados como medidas de rutina en cultivos celulares suspendidos de células mamíferas y de una vez analizar y observar los cambios en rutas metabólicas si alguno. Se espera que la implementación de esta metodología en línea y tiempo real resulte en una mayor comprensión de los cultivos celulares en tiempo real y un mejoramiento en la productividad de estos sistemas, así también como una herramienta para la implementación de técnicas de análisis de procesos. Ocho lotes de cultivos de células de un hámster chino fueron hechos bajo cuatro condiciones distintas. Los mejores parámetros o condiciones fueron aquellas con el rango de temperatura de 35-33°C con la sobre expresión en el medio del inhibidor apoptótico. Para ese caso, doce días de cultivo fueron alcanzados con un por ciento de viabilidad entre noventa y ochenta con un incremento substancial en L-lactato como metabolito secundario y una densidad celular constante en las corrida completa. En el caso de los lotes con las condiciones de rango de temperatura de 37°C y descendiendo a 33°C en un término de dos días y medio con sobre expresión del inhibidor, la data obtenida demuestra que aunque un porcentaje de viabilidad alto fue alcanzado, los días de la corrida no fueron extendidos y un incremento en L-lactato fue también observado. Este incremento demuestra la posibilidad de una doble inhibición por la sobre expresión del inhibidor apoptótico. Como consecuencia, estas inhibiciones simultáneas afectan el metabolismo de la células y evitan el proceso normal de gluconeogenesis; esto también es resaltado en un artículo publicado por Centocor con el uso de otro inhibidor apoptótico. El uso de Raman propuesto para monitorear el metabolismo celular y la apoptosis fue estudiado de manera invasiva extrayendo muestra y analizándola diariamente, proveyendo resultados prometedores para monitorear el metabolismo celular (mayormente metabolitos secundarios y primarios). En el caso de identificar o detectar cambios en la viabilidad todavía se está estudiando. Picos de algunos componentes intracelulares fueron identificados y deben ser estudiados para modelar cualquier incremento que pueda estar asociado con la supervivencia o muerte de las células.