Fungal diversity present at a hypersaline environment in Cabo Rojo, Puerto Rico, determined by characterization of isolates and analysis of environmental rRNA genes clones libraries

Abstract

Solar salterns are a thalassohaline environment where sea water is evaporated to obtain salt for commercial purposes. The prokaryotic diversity on these places has been extensively studied world wide. However, there are few reports that focus their attention on the fungal diversity present on this extreme environment. The main objective of this research project was to isolate and characterize halotolerant filamentous fungi from the salterns of Cabo Rojo, Puerto Rico. To determine the occurrence of fungi in these solar salterns, water samples were filtered, plated on three different media (Sehgal and Gibbons, malt extract, and potato dextrose) each at 15% NaCl and incubated at 29ºC. Selected isolates were characterized using light and scanning electron microscopy, and some physiological properties like secondary metabolite profiles, optimal NaCl concentration, pH and temperature were determined. Molecular analysis using RFLP patterns of a PCR amplicon containing the 5.8S rDNA and ITS1-ITS2 regions was also used to classify the isolates into groups. Taxonomic results indicated that several groups of fungi can be obtained from this hostile environment. A total of eight genera and seventeen species were reported. These include the filamentous fungi Alternaria sp. Aspergillus elegans, A. sydowii, A. terreus, A. versicolor, A oryzae, A. japonicus, A. niger aggregate, Cladosporium cladosporioides, C. sphaerospermum, Eurotium amstelodami, Penicillium chrysogenum, P. expansum, Stemphylium sp. and an unknown species. The dimorphic yeast, Hortaea werneckii, was also isolated at a high frequency. Many isolates tolerated NaCl concentrations up to 30% and showed a wide range of growth temperatures and pH. The ability of these isolates to grow at high salt concentrations might indicate that they are part of the biological diversity of the saltern. The fungal diversity was also analyzed by non-culture dependent methods like 18S rDNA clone libraries. The amplification of fungal DNA was very difficult to achieve due to the complexity of the saltern community. However, after protocol optimization many clones were obtained and an in silico analysis was performed. Environmental sequences belonging to the genus Aspergillus were the most frequent Operational Taxonomic Unit (OTU), but other ascomycetes and basidiomycetes OTUs were also obtained. The combination of morphological, physiological and molecular approaches was very useful to describe the fungal community at the solar salterns of Cabo Rojo. This survey represents one of the first approaches to study fungal diversity on extreme environments in the Caribbean.

Las salinas artificiales son un ambiente talasohalino en donde el agua de mar se evapora para obtener sal con propósitos comerciales. La diversidad procariótica de estos lugares ha sido extensamente estudiada. Sin embargo, muy pocos estudios enfocan su atención en conocer la diversidad de hongos presentes en aguas hipersalinas. El objetivo principal de este estudio fue aislar y caracterizar hongos filamentosos halotolerantes presentes en las salinas de Cabo Rojo, Puerto Rico. Para determinar la ocurrencia de hongos en estas salinas, se filtraron muestras de agua y se colocaron en platos conteniendo tres medios de cultivo diferentes: medio de Seghal y Gibbons, agar de papa y dextrosa y agar de extracto de malta cada uno con 15% de NaCl. Las muestras se incubaron a 29˚C. Se caracterizaron los aislados seleccionados utilizando microscopía de luz y microscopía electrónica de rastreo, propiedades fisiológicas como la producción de metabolitos secundarios, concentración óptima de NaCl, así como condiciones óptimas de pH y temperatura. Se realizó una caracterización molecular utilizando los patrones de restricción de la región que contiene la ITS1-5.8S-ITS2 del rADN para clasificar los aislados. Los resultados taxonómicos indican que se pueden recuperar hongos de este ambiente hostil. Un total de 8 géneros y 17 especies fueron encontradas. Entre los hongos filamentosos aislados se encuentran: Alternaria sp. Aspergillus elegans, A. sydowii, A. terreus, A. versicolor, A oryzae, agregado de A. niger, Cladosporium cladosporioides, C.sphaerospermum, Eurotium amstelodami, Penicillium chrysogenum, Penicillium sp., Stemphylium sp. y una especie desconocida. también se aisló en alta frecuencia la levadura dimórfica Hortaea werneckii. Muchos de los aislados toleraron hasta una concentración de NaCl de 30% y mostraron crecimiento en una gama de valores de temperatura y pH . La habilidad de las cepas de tolerar altas concentraciones de sal podría indicar que éstas pueden ser parte de la diversidad biológica de las salinas. La diversidad presente en las salinas también se estudio utilizando métodos no dependientes de cultivo como las bibliotecas de 18S del rADN. La amplificación del ADN de hongos fue muy difícil de lograr debido a la complejidad de la comunidad de las salinas. Sin embargo, luego de la optimización de los protocolos se obtuvo muchos clones y se realizó un análisis in silico. Secuencias ambientales pertenencientes al género Aspergillus fueron las unidades taxonómicas operacionales (UTO) obtenidas en mayor frecuencia, pero también se obtuvo UTOs relacionados a otros ascomicetos y basidiomicetos. La combinación de las técnicas morfológicas, fisiológicas y moleculares fue útil para describir la comunidad de hongos en las salinas de Cabo Rojo. Este catastro representa uno de los primeros esfuerzos en estudiar la diversidad de hongos en un ambiente extremo en el Caribe.