Quantification of the transcriptional activity of genes associated with cyanogenesis in Cassava (Manihot esculenta Crantz)

Abstract

Cassava has cyanogenic glycosides in its roots and leaves. These compounds function in plants as protective agents against herbivores as well as the translocable form of reduced nitrogen. The genes involved in the cyanogenic pathway [CYP79D1, CYP79D2, linamarase, α-hydroxynitrile lyase (HNL) and β-cyanoalanine synthase (β-CAS)] have been identified, though very little is known regarding their transcriptional regulation. Our work aimed to identify the differential expression of these genes using conventional PCR and Real Time PCR in cassava plants of different cultivars grown in vitro under different environment conditions. Four experiments were designed to accomplish this objective: 1. Semiquantitative comparison of the transcriptional activity in leaves and roots of two cassava cultivars using conventional PCR; 2. Quantitative comparison of the transcriptional activity in leaves and roots of three cassava cultivars using Real-Time PCR; 3. Quantitative comparison of the transcriptional activity in leaves and roots of two cassava cultivars under reduced nitrogen stress using Real-Time PCR; 4. Quantitative comparison of the transcriptional activity in leaves and roots of two cassava cultivars under temperature stress using Real-Time PCR. Statistical analyses demonstrated a higher expression of the genes in leaves relative to the roots, consistent with the fact that cyanogens are synthesized predominantly in the leaves and subsequently transported to the roots where they are converted to proteins. In the comparison of the expression among three cultivars, the results suggest that differences in cyanide content in roots could be explained by the coordinated cyanogenic glycoside synthesis in leaves and the linamarase catabolic step in the roots. The comparison under reduced nitrogen stress shows the impact of this environmental condition over the expression pattern of these genes. Thus, it is reported that CYP79D1/D2 genes increase their transcriptional activity in inverse relation to reduced nitrogen concentration in roots after one day of stress; while the β-CAS gene responds in direct relation to reduced nitrogen concentrations in leaves and roots primarily after 10 days of stress. The results obtained from the temperature stress experiment illustrate an influence of temperature on β-CAS gene expression, though this result was not considered a direct effect of temperature stress over the general cyanogenic glycoside pathway in cassava. Finally, multivariate analysis of the expression of those genes suggest a correlation between the expression of linamarse and HNL genes (involved in the breakdown of linamarin) and among CYP79D1/D2 and β-CAS. This fact is corroborated by the responses of CYP79D1/D2 and β-CAS genes under reduced nitrogen stress, as well as the antecedents that illustrate the linamarase and HNL protein are located separately in the cell wall. This is the first study that evaluate the transcriptional activity of the genes (known to date) involved in the cyanogenic glycoside metabolism in an integral way. The results show the complexity of cyanogenic glycosides metabolism in cassava.

La yuca contiene glicósidos cianogénicos en sus raíces y hojas. Estos compuestos funcionan en las plantas como agentes protectores contra herbívoros, así como fuente de nitrógeno reducido translocable. Los genes involucrados en el metabolismo de estos compuestos [CYP79D1, CYP79D2, linamarasa, alpha-hydroxynitril liasa (HNL) y βcianolalanina sintasa (β-CAS)] han sido identificados, aunque poco es conocido respecto a su regulación transcripcional. Nuestro trabajo se enfocó en conocer la expresión diferencial de estos genes usando PCR convencional y PCR en Tiempo Real en plantas in vitro de yuca de diferentes cultivares bajo diferentes condiciones ambientales. Cuatro experimentos fueron diseñados para llevar a cabo este objetivo: 1. Comparación semicuantitativa de la actividad transcripcional en hojas y raíces de dos cultivares de yuca usando PCR convencional; 2. Comparación cuantitativa de la actividad transcripcional en hojas y raíces de tres cultivares de yuca usando PCR en Tiempo Real; 3. Comparación cuantitativa de la actividad transcripcional en hojas y raíces de dos cultivares de yuca bajo estrés de nitrógeno reducido usando PCR en Tiempo Real; 4. Comparación cuantitativa de la actividad transcripcional en hojas y raíces de dos cultivares de yuca bajo estrés de temperatura usando PCR en Tiempo Real. Los análisis estadísticos mostraron una alta expresión de los genes en hojas en relación a las raices, lo cual es consistente con el hecho de que los glicósidos cianogénicos son sintetizados principalmente en las hojas y luego transportados a las raíces donde son convertidos a proteínas. En la comparación de la expresión entre tres cultivares, los resultados sugieren que las diferencias en contenido de cianuro en las raíces pueden ser explicadas por la coordinación entre la síntesis de glicósidos cianogénicos en las hojas y la acción catalítica de la linamarasa en las raíces. Las comparaciones bajo estrés de nitrógeno reducido muestran el impacto de esta condición ambiental sobre el patrón de expresión de estos genes. De esta manera, se reporta que los genes CYP79D1/D2 aumentan su actividad transcripcional en raíces en el primer día de estrés en inversa relación a la concentración de nitrógeno reducido; mientras que la expresión del gen β-CAS en hojas responde en directa relación a la concentración de nitrógeno reducido a los 10 días de estrés principalmente. Los resultados obtenidos del experimento de estrés de temperatura muestran un impacto sobre la expresión del gen β-CAS, aunque este resultado no es considerado como un efecto directo de la temperatura sobre el metabolismo de los glicósidos cianogénicos en la yuca. Finalmente los análisis multivariados de la expresión de estos genes sugieren una correlación en la expresión de la linamarasa y el gen HNL (los cuales están implicados en la degradación de la linamarina) y entre CYP79D1/D2 y β-CAS. Este hecho es corroborado por la respuesta de CYP79D1/D2 y β-CAS bajo el estrés de nitrógeno, así como por los antecedentes que ilustran que la linamarasa y la proteína de HNL están localizadas de manera separada en la pared celular. Este es el primer estudio que evalua la actividad transcripcional de los genes (conocidos a la fecha) envueltos en el metabolismo de los glicósidos cianogénicos de manera integral. Los resultados muestran la complejidad del metabolismo de los glicósidos cianogénicos en la yuca.