Román Zea, Denisse

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    Identificación de Pseudocercospora fijiensis mediante amplificación isotérmica mediada por bucle
    (2022-05-20) Román Zea, Denisse; Feliciano-Rivera, Merari; College of Agricultural Sciences; Giraldo-Zapata, Martha C.; Rivera-Vargas, Lydia I.; Department of Crops and Agro-Environmental Sciences; Colón-Reyes, Omar
    El mayor ingreso agrícola en Puerto Rico proviene de los cultivos farináceos, siendo los bananos y plátanos los principales cultivos de este grupo. Las musáceas se ven afectadas por muchos patógenos, pero la enfermedad más limitante en la producción es la sigatoka negra. El hongo hemibiotrófico Pseudocercospora fijiensis es el agente causal de la sigatoka negra. Este patógeno coloniza la planta a través de los estomas y, una vez que la infecta, comienza a necrotizar el tejido. El manejo de la sigatoka negra se basa principalmente en la aplicación continua de fungicidas, aumentando los costos de producción tanto para los agricultores como para los consumidores. La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) utiliza de cuatro a seis cebadores y una polimerasa con actividad de desplazamiento para amplificar el ADN. El uso de una polimerasa con actividad de desplazamiento permite que la reacción se lleve a cabo a temperaturas constantes, evitando costosos equipos de laboratorio. LAMP no requiere equipo de laboratorio especializado; solo necesita una fuente de calor constante. Esto permite realizar la técnica en el campo utilizando equipos portátiles. Esta investigación tiene como objetivo desarrollar un ensayo LAMP para identificar a P. fijiensis. Esta investigación también examinará el efecto de los medios de cultivo PDA y PDB en el crecimiento y la esporulación de P. fijiensis bajo luz roja. La optimización de LAMP evaluó diferentes parámetros, como el número de cebadores, la concentración de los cebadores y el tiempo de incubación. Además, se comparó la sensibilidad de LAMP con la técnica de PCR convencional. La especificidad de LAMP se evaluó con otros hongos fitopatógenos de diferentes géneros. Las condiciones óptimas para la amplificación mediada por LAMP fueron el uso de seis cebadores a una concentración final de 0.25x durante 20 minutos. Al aumentar el tiempo de incubación, LAMP pudo amplificar muestras de ADN con concentraciones de 1 x 10-2 ng/μl. No se observó amplificación en ninguno de los géneros de hongos analizados, lo que demuestra la especificidad del ensayo LAMP desarrollado. Finalmente, esta técnica pudo identificar P. fijiensis a partir de tejido micelial y tejido vegetal infectado con diferentes niveles de severidad. Un ensayo LAMP para detectar P. fijiensis en plantas enfermas en diferentes grados de severidad, con alta sensibilidad y especificidad, fue validado con éxito con un tiempo de amplificación de 60 minutos. A los 14 días, el crecimiento de P. fijiensis fue significativamente mayor en el medio PDA que en PDB. Sin embargo, después de 21 días, no hubo diferencia significativa en el crecimiento de ambos medios de cultivo. En ninguno de los medios de cultivo se observaron conidios.