Oyola Rivera, Miguel X.
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Publication Partial purification of agarases from halophilic microorganisms isolated from marine and hypersaline environments in Puerto Rico(2017) Oyola Rivera, Miguel X.; Montalvo Rodríguez, Rafael R.; College of Arts and Sciences - Sciences; Santos Flores, Carlos J.; Rodríguez Minguela, Carlos M.; Department of Biology; Parés Matos, Elsie I.Las agarasas son enzimas que son capaces de catalizar la hidrólisis de agar. Se clasifican en dos grupos, que son α-agarasa y β-agarasa, de acuerdo con el patrón de escisión. Varias agarasas se han aislado de diferentes géneros de bacterias que se encuentran en agua de mar y sedimentos marinos, así como microorganismos modificados genéticamente. El agar es un producto ficocoloide extraído de la pared celular de un grupo de algas rojas (Rhodophyceae) que incluye especies de Gelidium y Gracilaria. Estudios recientes han demostrado el gen de agarasa (AgaV) puede ser útil en dos aspectos: en primer lugar, como una enzima agarolítica, el AgaV recombinante purificada podría ser empleada en la recuperación de ADN a partir de geles de agarosa; en segundo lugar, como una proteína de secreción, AgaV se exploró en el nivel genético y se utilizó como un reportero en la construcción de una trampa de señal de secreción, que resultó ser una herramienta molecular simple y eficiente para la selección de genes que codifican proteínas de secreción de bacterias tanto en Gram-positivas y Gram-negativas. Según nuestro conocimiento, no se han publicado estudios sobre agarasas en Puerto Rico y debido a esto, el propósito de este estudio es examinar las muestras de agua que fueron tomadas de ambientes marinos (3.5% - 5.0% w / v de NaCl) y halófilicos (6% -30% w / v de NaCl) de Puerto Rico. Las muestras fueron recolectadas en bolsas estériles Whirl-pak® y fueron transportadas al laboratorio para ser procesadas. Las muestras de agua fueron concentradas por filtración con una membrana de 0.45 μm. Los aislados fueron crecidos en medio con extracto de levadura, medio sin extracto de levadura, medio con extracto de levadura y agarosa, y medio sin extracto de levadura con agarosa molecular, demostrando que pueden degradar el agar en medios con o sin nutrientes. El medio de crecimiento es una versión modificada del medio “Synthetic Crenarcheota” (Könneke et al., 2005). Un total de 55 aislados fueron obtenidos del muestreo, 17 de éstos demostraron la capacidad de degradar agar. Los aislados fueron caracterizados utilizando propiedades físicas, moleculares y morfológicas. Se realizó un análisis del gen de ARN ribosomal 16S, luego se analizó el ADN metagenómico utilizando la reacción de polimerasa en cadena, lo cual demostró la presencia de bacterias y arqueas halofílicas. Los resultados preliminares indican que tenemos 17 aislados que pertenecen al dominio Bacteria y tienen actividad de agarasa. Este experimento puede contribuir al esclarecimiento sobre la diversidad y función de la enzima agarasa en ambientes halófilicos en Puerto Rico. El aislado MD25A produce una agarasa tipo beta, la cual exhibe una salinidad óptima de 1.5 M NaCl, una temperatura óptima de 37⁰C, un pH de 8, es termoestable y tiene una vida media por 60 min a 50⁰C. La producción inducida de la agarasa se hizo en el medio HA-I que contenía una solución al 0.2% de agarosa. La enzima purificada resultó ser homogénea y su peso molecular es de aproximadamente 80 kDa, como se observó en el “SDS-PAGE”. Los oligosacáridos producidos por la degradación del agar fueron analizados por cromatografía de capa fina. La agarasa generó los productos de degradación en el siguiente orden: neoagarohexaosa, neoagarotetraosa y una pequeña cantidad de neoagarobiosa. Estos resultados sugieren que nuestra enzima es una β-agarasa.