Biophysical studies: Interaction of the Aptamer-protein complexes

Abstract

Aptamers are synthetic nucleotides used as probes for a plethora of molecules. Their applications include therapeutics, biosensors, drug delivery, among others. Aptamers bind strongly and selectively to a target because of their ability to adopt different three-dimensional structures that form complementary shapes that fit very well into the recognition site. To understand the binding mechanism of Aptamers and to optimize the design of Aptamer-based technologies, it is necessary to understand the details of the Aptamer folding and target interactions from a structural perspective. Unfortunately, while the number of publications of Aptamer applications keeps growing, there is scant research on Aptamers from a structural perspective. This dissertation addresses that knowledge gap by employing two different approaches. The structural characterization of a DNA Aptamer-protein complex using X-ray Crystallography, and the analysis and identification of common patterns within Aptamer sequences using Machine Learning (ML). Two DNA Aptamer-protein pairs were chosen for characterization by X-ray Crystallography: IBA-Insulin and LyApt-Lysozyme. The analysis of the interaction between the DNA Aptamer IBA and Insulin suggests that this Aptamer binds to its target trough the induced-fit model, stabilized by hydrophobic, electrostatic, and non-covalent interactions. Meanwhile in the crystal structure of the DNA Aptamer LyApt and Lysozyme, the Aptamer shows a lack of a folding motif, and the stability of the complex is mainly driven by non-covalent interactions, thus forcing the Aptamer to bind the Lysozyme's heparin binding sites. In both cases, these DNA Aptamers are binding to “hot-spots” within the target proteins. In machine learning analyses, DNA sequences were broken into six nucleotide motifs called 6-mers. From their modeling, it was found that Aptamers have a high “GT” content and the 6-mers with the highest relevance across all ML models were TGG TGG, TGG GGG, GGG GTG, GGT TGG, GCA CAG and GGG GGG. These six 6-mers are found to be involved in protein binding or are structurally significant within the Aptamers. These results expand the understanding of where within a protein, does an Aptamer bind and it can be helpful in the future design of SELEX experiments by developing new screening libraries, overexpressing the promising 6-mers or by pre-selecting sequences as potential Aptamers.

Los aptámeros son nucleótidos sintéticos que se utilizan como sondas para una gran cantidad de moléculas. Sus aplicaciones incluyen fármacos, biosensores, distribución de drogas, entre otros. Los aptámeros se enlazan fuerte y selectivamente a su molécula de enlace gracias a su capacidad de adoptar diferentes estructuras tridimensionales que se pliegan en formas complementarias y se acoplan muy bien al sitio de reconocimiento. Para entender el mecanismo de unión de los aptámeros y optimizar el diseño de las tecnologías basadas en ellos, es necesario comprender los detalles del plegamiento del aptámero y las interacciones con su molécula de enlace desde una perspectiva estructural. Desgraciadamente, aunque el número de publicaciones sobre las aplicaciones de los aptámeros ha crecido mucho, hay muy poca investigación sobre los aptámeros desde una perspectiva estructural. Esta tesis aborda esa laguna de conocimiento empleando dos enfoques diferentes. La caracterización estructural de un aptámero de ADN en complejo con una proteína utilizando cristalografía de rayos X y el análisis e identificación de patrones comunes dentro de las secuencias de aptámeros utilizando “Machine Learning.” Se seleccionaron dos complejos aptámero de DNA-proteína para la caracterización por cristalografía de rayos X: IBA-insulina y LyApt-Lisozima. El análisis de la interacción entre el aptámero de DNA IBA y la Insulina sugiere que el aptámero se une a su objetivo a través del modelo de ajuste inducido y se estabiliza por interacciones hidrofóbicas, electrostáticas y no covalentes. En la estructura cristalográfica del aptámero de DNA LyApt con Lisozima, el aptámero muestra una falta de estructura tridimensional, donde la estabilidad del complejo se debe principalmente a las interacciones no covalentes, haciendo que el aptámero se una al sitio de enlace de la heparina en la lisozima. En ambos casos, los aptámeros se unen a "hot-spots" dentro de las proteínas de interés. En el análisis de “Machine Learning”, las secuencias de ADN se dividieron en motivos de seis nucleótidos llamados “6-mers”. A partir de la modelización, se pudo observar que los aptámeros tienen un alto contenido de "GT" y los “6-mers” con mayor relevancia en todos los modelos ML fueron TGG TGG, TGG GGG, GGG GTG, GGT TGG, GCA CAG y GGG GGG. De acuerdo con la literatura, estos seis “6-mers” están implicados en enlaces a las proteínas, al igual que llevan a cabo un rol estructural. Estos resultados amplían la comprensión de dónde se une un aptámero a la proteína y pueden ser útiles para el diseño de futuros experimentos SELEX mediante el desarrollo de nuevas bibliotecas de selección que sobre-expresen los “6-mers” identificados o mediante la preselección de secuencias como potenciales aptámeros.