Interaction between the fungus-growing ant Cyphomyrmex minutus and its symbionts at Cambalache Forest, Puerto Rico

Abstract

The ants in the tribe Attini cultivate a fungus (Basidiomycota: Agaricales) as food and protect it from specific mycoparasites, Escovopsis (Ascomycota: Hypocreales), using the antibiotic production capacity of Actinobacteria (Pseudonocardia) associated with its exoskeleton. Attini nests are not axenic environments; several other microorganisms (bacteria and fungi) with undescribed roles interact with the ant and the principal symbionts. In addition, the ants show characteristic hygienic behaviors that include farming and grooming of the cultivar and creating, rearranging, and transporting piles of organic refused material in and out of the nest. Currently, 5 different agricultural practices have been described among the Attini and only the members of the Cyphomyrmex rimosus group maintain their cultivar in yeast form. All other groups of the Attini cultivate their fungi in mycelial form. Although the interaction in the attine ant symbiosis has been extensively studied, the yeast-cultivating ants and their microbial associates have not been described. In Puerto Rico, Cyphomyrmex minutus is the only attine species that practices yeast agriculture. We investigated the microbial community associated with C. minutus including the specific cultivar, the possible mycoparasite and the Actinobacteria. We sampled a total of 26 nests of C. minutus during the Dry and Rainy seasons at Cambalache Tropical Forest in Puerto Rico. A combination of culture-dependent and independent techniques was used to describe the fungi and Actinobacteria isolated from different components of the nest. We identified the yeast cultivar by sequencing the 28S rDNA gene. We also isolated and identified the fungi associated with the cultivar using morphology and ribosomal operon ITS sequencing. Furthermore, we created a clone library of the fungal ITS region from the organic refuse material in search of pathogens. Actinobacteria genera from the ant exoskeleton and the cultivar were analyzed using 16S rDNA gene. The microbial community associated with C. minutus differs significantly from other attine ants. The specific pathogen, Escovopsis, was not found in association with the cultivar nor the refuse material. Pseudonocardia was not the prevalent actinobacterium genus in the association, but instead Streptomyces strains were commonly recovered. Our studies strongly support the hypothesis that the ant maintains the cultivar in yeast form as an adaptation to escape pathogen infection.

Las hormigas en la tribu Attini cultivan un hongo (Basidiomycota: Agaricales) como fuente de alimento y lo protegen del micoparásito específico Escovopsis (Ascomycota: Hypocreales) utilizando la capacidad de producción de antibióticos de actinobacterias asociadas a su exoesqueleto (Pseudonocardia). Los nidos de las Attini no son ambientes axénicos en adición a los principales simbiontes varios microorganismos (bacterias y hongos), han sido reportados interactuando con los diferentes componentes del nido y sus simbiontes. Los roles de estos microorganismos permanecen sin describir. Las Attini presentan comportamientos higiénicos característicos que incluyen la inspección y el aseo del cultivar y la creación, rearreglo y transportación de pilas de material orgánico considerado como desecho fuera del nido. Hasta el momento se han identificado 5 tipos de agricultura entre las Attini; solamente las especies del grupo Cyphomyrmex rimosus mantienen su cultivar a manera de levadura, los otros 4 grupos cultivan su hongo como micelio. A pesar de que la interacción entre las hormigas Attini y sus simbiontes ha sido extensamente estudiada, las hormigas que cultivan a manera de levadura y los microorganismos asociados a éstas permanecen sin describir. En Puerto Rico, Cyphomyrmex minutus es la única especie de Attini que practica agricultura de levaduras. En este estudio se describió la comunidad microbiana asociada a C. minutus incluyendo el cultivar, el micoparásito y las actinobacterias. Un total de 26 nidos de C. minutus fueron muestreados durante las épocas seca y lluviosa en el bosque de Cambalache en Puerto Rico. Una combinación de técnicas independientes y dependientes de cultivo fueron utilizadas para describir la comunidad de hongos y actinobacterias asociadas a diferentes componentes del nido. El cultivar fue identificado mediante la secuenciación del gen 28S rADN. Además se aislaron e identificaron los hongos asociados al cultivar utilizando caracteres morfológicos y secuenciación de la región ITS del operon ribosomal. Se creó una biblioteca de clones (región ITS del rDNA) del material de desecho que permitió describir la comunidad de hongos asociados a dicho sustrato en busqueda de patogenos. Por otro lado para la identificación de las actinobacterias asociadas al exoesqueleto y al cultivar de C. minutus se analizó el gen 16S rADN. La comunidad microbiana asociada a C. minutus difiere significativamente de las descritas para otras Attini. El micoparásito, Escovopsis, no fue detectado en asociación al cultivar o al material de desechos de C. minutus. Pseudonocardia no fue el género de Actinobacteria prevalente en asociación con esta Attini. Por el contrario, cepas de Streptomyces fueron comúnmente recuperadas. Nuestros estudios apoyan la hipótesis de que las Attini mantienen el cultivar a manera de levadura como una adaptación para prevenir infección de patógenos.