Molecular biophysical characterization of a novel centrin-krr1 complex

Abstract

The nucleus is the natural compartment for DNA in eukaryotes. This compartment is also the setting for genetic mutations, nucleotide excision repair (NER), and ribosome biogenesis. The study of protein-protein interactions (PPIs) and protein-DNA interactions is the key to understanding these processes in the cell. Abnormalities in ribosome biogenesis cause specific clinical syndromes and recently have been associated with tumorigenesis. One example involves the KH domain of Krr1, which has been identified as a single-stranded DNA (ssDNA) recognition motif. Centrin, an essential calcium binding protein, has been found to regulate NER within the nucleus. Krr1, a novel centrin target, is required for ribosome biogenesis. The structure of Homo sapiens Krr1 (HsKrr1) has not been determined to date. We describe the spectroscopic characterization of the GXXG loop peptide (GXXGlp), which is present in KH domain-containing proteins. The sequence of HsKrr1’s GXXGlp is evolutionarily conserved and has been associated with ssDNA interaction and ribosome biogenesis. 2D IR correlation spectroscopy was used to determine the stability of GXXGlp, as a synthetic peptide, and the optimal formulation conditions for the use of the peptide. We observed differences in the molecular behavior of GXXGlp in the presence and absence of trifluoroacetate at various peptide concentrations. 2D IR correlation spectroscopy was also used for the elucidation of the unfolding process, the mechanism and extent of peptide aggregation, and the effect of TFA on the stability of the peptide. This spectroscopic method can be applied to the characterization of any synthetic peptide. Furthermore, our findings indicate a GXXGlp-ssDNA interaction. We used the same technique to assess the stability of the complex via thermal perturbation. Preliminary studies identified a Hscentrin2-GXXGlp interaction using NMR, indicating that the interaction occurs in the C-terminal domain of Hscentrin, the Ca2+-dependent domain. New signals in the 2D HSQC centrin-GXXGlp titration experiments suggest that centrin adopts a new conformation upon binding to GXXGlp, exposing amino acids located in the EF hands of the C-terminal domain. Moreover, these studies identified a novel interaction between HsKrr1 and Hscentrin2’s C-terminal domain.

El núcleo es un compartimiento natural para el ADN en las células eucariotas. Este compartimento también es el escenario de mutaciones genéticas, reparación de escisión nuclear (REN) y del comienzo de la generación de ribosomas. El estudio de las interacciones proteína-proteína (IPP) y las interacciones proteína-ADN (IPA) es la clave para entender muchos de los procesos regulatorios en la célula. Anomalías en la generación de los ribosomas causan síndromes clínicos específicos y recientemente se han asociado con la creación de tumores. Un ejemplo envuelve el dominio homólogo K (KH) de Krr1 que se ha identificado que reconoce ácidos nucleicos de hebra sencilla (ADNhs). Centrin, una proteína esencial que enlaza a calcio forma parte de las proteínas que regulan REN en el núcleo mientras que Krr1, un nuevo blanco de centrin, es necesario para la creación de ribosomas. La estructura de Homo sapiens Krr1 (HsKrr1) no se ha resuelto aún. Se describió la caracterización espectroscópica del péptido GXXG (GXXGlp), que está presente en las proteínas que contienen el dominio KH. La secuencia de HsKrr1 GXXGlp se conserva evolutivamente y se ha asociado con la interacción ADNhs y la creación de ribosomas. La espectroscopía de correlación en infrarrojo de dos dimensiones (IR 2D) se utilizó para determinar la estabilidad del GXXGlp, como péptido sintético, y las condiciones de formulación óptimas para el uso del péptido. Se observó diferencias en el comportamiento molecular del GXXGlp en presencia y ausencia de ácido trifluoroacético (ATF) a diversas concentraciones de péptido. Con la espectroscopía de correlación IR 2D se determinó el proceso de despliegue, el mecanismo, la extensión de la agregación de péptidos, y el efecto de ATF sobre la estabilidad del péptido, demostrando que este método espectroscópico se puede aplicar a la caracterización de cualquier péptido sintético. Además, los resultados han identificado la interacción GXXGlp-ADNhs y la estabilidad del complejo con perturbación térmica utilizando la misma técnica. La interacción Hscentrin-GXXGlp se identificó utilizando estudios en dos dimensiones de resonancia magnética nuclear (RMN), lo que indica que la interacción tiene lugar en el dominio C-terminal de Centrin, el dominio dependiente de calcio. Las nuevas señales en los resultados de los experimentos de RMN sugieren que centrin adopta una nueva conformación exponiendo los aminoácidos localizados en su dominio del C-terminal.