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Structural changes of ยนยณCโlabelled ๐๐ฉ๐ญ๐ข๐ฎ๐บ๐ฅ๐ฐ๐ฎ๐ฐ๐ฏ๐ข๐ด centrin and melittin upon complex formation in the presence of calcium
Del Valle Sosa, Liliana
Del Valle Sosa, Liliana
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Abstract
Chlamydomonas centrin is an acidic, low molecular weight protein that belongs to the EF-hand superfamily of calcium binding proteins. It is an essential component of the centrosomal structure in a wide range of organisms. ยนยณC-labeled Chlamydomonas centrin (ยนยณC-Cen) and a model peptide from bee venom, known as melittin (MLT) were studied upon complex formation. The main objective of this thesis was to study the level of protein/peptide interaction, to explore structural changes and the relative stability of centrin, mellitin, and the complex. Two sets of experiments were performed HโD exchange via attenuated total reflectance (ATR) and thermal dependence via transmission Fourier transform-infrared (FT-IR) spectroscopy. The spectral analysis was carried-out by two-dimensional correlation analysis (2D-COS). In addition, differential scanning calorimetry (DSC) experiments were performed to corroborate the existence of pre-transitions and the thermal denaturation temperature for these proteins and the complex. For the FT-IR studies, the two protein components were studied simultaneously as: the amide Iโ band (1650 cmโปยน) for MLT and the amide I*โ band (1600 cmโปยน) for ยนยณC-Cen in order to establish the structural changes during the interaction. Furthermore, the amide II band (1550 cmโปยน) comprised of side chains and the N-H deformation mode, and the amide IIโ (1450 cmโปยน) band comprised of the N-D deformation mode for both proteins are studied to determine side chain interaction and the extent of solvation (80% for ยนยณC-Cen, 100% for MLT and 100% ยนยณC-Cen/MLT). The interaction within the protein complex, was driven by MLT, which was suggested from the effects observed in the ฮฑ-helical motifs of centrin to a greater extent than its interaction with calcium. This effect was observed for the calorimetric studies whereby centrin pre-transition was shifted by 13 ยฐC from 81 ยฐC to 95 ยฐC. Finally, these results provide the framework to study other centrin target peptides to further understand the biophysical and biochemical changes driving their interaction.
Chlamydomonas centrina es una proteรญna รกcida, de bajo peso molecular que pertenece a la superfamilia de proteรญnas de manos EF que enlazan calcio. Esta es un componente esencial de la estructura centrosomal de un amplio rango de organismos. La centrina de Chlamydomonas marcada con carbono 13 (ยนยณC-Cen) y un pรฉptido modelo del veneno de la abeja, conocido como meletina (MLT), fueron estudiados en la formaciรณn del complejo. El principal objetivo de esta tesis fue el estudio del nivel de interacciรณn proteรญna/pรฉptido, para examinar los cambios estructurales y la estabilidad relativa de centrina, meletina y la del complejo. Se realizaron dos tipos de experimentos: se estudiรณ el intercambio HโD a travรฉs de la reflactancia atenuada total (ATR) y luego, se analizรณ la dependencia termal utilizando la espectroscopรญa de transmisiรณn de infrarrojo con transformada de Fourier (FT-IR) en la cuales los espectros se analizaron mediante el estudio de correlaciรณn en dos dimensiones (2D-COS). Ademรกs, se realizaron experimentos de calorimetrรญa diferencial de barrido (DSC) para corroborar la existencia de pre-transiciones y la temperatura de desnaturalizaciรณn termal de estas proteรญnas y el complejo. Para los estudios de FT-IR, los dos componentes proteรญcos fueron analizados simultรกneamente como: la banda amida Iโ (1650 cmโปยน) para MLT y la banda amida I*โ (1600 cmโปยน) para ยนยณC-Cen para los cambios estructurales durante la interacciรณn. Tambiรฉn, se analizaron la banda amida II (1450 cmโปยน) comprendida por el modo de deformaciรณn N-H (1550 cmโปยน) y las cadenas laterales y la banda amida IIโ comprendida por el modo de deformaciรณn N-D (1550 cmโปยน) para determinar la interacciรณn de las cadenas laterales y el grado de solvataciรณn (80% para ยนยณC-Cen, 100% para MLT y 100% ยนยณC-Cen/MLT). La interacciรณn entre el complejo de proteรญnas, esta dominada por MLT, lo que es sugerido por los efectos observados en los motivos ฮฑ-hรฉlices de centrina a un mayor grado que su interacciรณn con calcio. Este efecto se observรณ en los estudios de calorimetrรญa en donde la pre-transiciรณn de centrina se desplazรณ en 13 ยฐC, de 81 ยฐC a 95 ยฐC. Finalmente, estos resultados que apoyan para el estudio de otros pรฉptido blancos de centrina para poder entender los cambios biofรญsicos y bioquรญmicos que conducen a su interacciรณn.
Chlamydomonas centrina es una proteรญna รกcida, de bajo peso molecular que pertenece a la superfamilia de proteรญnas de manos EF que enlazan calcio. Esta es un componente esencial de la estructura centrosomal de un amplio rango de organismos. La centrina de Chlamydomonas marcada con carbono 13 (ยนยณC-Cen) y un pรฉptido modelo del veneno de la abeja, conocido como meletina (MLT), fueron estudiados en la formaciรณn del complejo. El principal objetivo de esta tesis fue el estudio del nivel de interacciรณn proteรญna/pรฉptido, para examinar los cambios estructurales y la estabilidad relativa de centrina, meletina y la del complejo. Se realizaron dos tipos de experimentos: se estudiรณ el intercambio HโD a travรฉs de la reflactancia atenuada total (ATR) y luego, se analizรณ la dependencia termal utilizando la espectroscopรญa de transmisiรณn de infrarrojo con transformada de Fourier (FT-IR) en la cuales los espectros se analizaron mediante el estudio de correlaciรณn en dos dimensiones (2D-COS). Ademรกs, se realizaron experimentos de calorimetrรญa diferencial de barrido (DSC) para corroborar la existencia de pre-transiciones y la temperatura de desnaturalizaciรณn termal de estas proteรญnas y el complejo. Para los estudios de FT-IR, los dos componentes proteรญcos fueron analizados simultรกneamente como: la banda amida Iโ (1650 cmโปยน) para MLT y la banda amida I*โ (1600 cmโปยน) para ยนยณC-Cen para los cambios estructurales durante la interacciรณn. Tambiรฉn, se analizaron la banda amida II (1450 cmโปยน) comprendida por el modo de deformaciรณn N-H (1550 cmโปยน) y las cadenas laterales y la banda amida IIโ comprendida por el modo de deformaciรณn N-D (1550 cmโปยน) para determinar la interacciรณn de las cadenas laterales y el grado de solvataciรณn (80% para ยนยณC-Cen, 100% para MLT y 100% ยนยณC-Cen/MLT). La interacciรณn entre el complejo de proteรญnas, esta dominada por MLT, lo que es sugerido por los efectos observados en los motivos ฮฑ-hรฉlices de centrina a un mayor grado que su interacciรณn con calcio. Este efecto se observรณ en los estudios de calorimetrรญa en donde la pre-transiciรณn de centrina se desplazรณ en 13 ยฐC, de 81 ยฐC a 95 ยฐC. Finalmente, estos resultados que apoyan para el estudio de otros pรฉptido blancos de centrina para poder entender los cambios biofรญsicos y bioquรญmicos que conducen a su interacciรณn.
Description
Date
2006