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Biocatalytic activity screening for the advanced glycation end product (Nε-Carboxymethyl-Lysine) in metagenomics libraries
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Abstract
Throughout the years, our body tends to accumulate a great variety of small molecules that are incapable of being metabolized or eradicated from our system. As the concentration of these molecules increases, they start having ill effects on our health and are often related to a great variety of aging diseases. For instance, the Advanced Glycation End product known as Nε- (carboxymethyl)-Lysine (CML) plays an important role in the development of secondary pathologies associated with diabetes. The CML has also been found to induce steatosis in non-alcoholic fatty liver. Even though the production of CML can be inhibited, the small molecule remains present in the affected tissue and crossed-linked proteins. Thus, the development of enzymatic based treatments that could remove substantially the accumulated CML would be highly beneficial to our society. In order to find a biocatalytic agent for CML, we implemented functional metagenomics by screening on minimal medium supplemented with CML. Four metagenomic libraries were screened using this method: one from the sub-tropical rainforest, El Yunque, another one from the dry forest at Guánica, other one from benthic microbial mat and the last one from an ephemeral microbial mat found at Cabo Rojo. A total of 178 clones were isolated from all the libraries. The study was focused on the RBI-3 clone from El Yunque metagenomic library. Transposition mutagenesis was performed with Tn5 transposon in order to generate random mutants that could knock out the activity. Each mutant was sequenced using Sanger sequencing. The clone was fully sequenced using Illumina Mi-Seq platform and assembled by 𝘥𝘦 𝘯𝘰𝘷𝘰 assembly and hybrid Sanger-Illumina template assembly. Automated annotation was performed by the RAST pipeline, and manual annotations were made near the Tn5 insertion sites. Four predicted candidate genes were characterized via phylogenetic protein analysis due to the proximity to the Tn5 insertion site. A predicted sulfite oxidase was used on a 𝘵𝘳𝘢𝘯𝘴 complementation assay, as result the experimental data demonstrated that the activity of this gene was rescued and granting 𝘌. 𝘤𝘰𝘭𝘪 EPI300 the ability to use CML as sole carbon source. These findings could lead to the development of 𝘪𝘯 𝘷𝘪𝘵𝘳𝘰 assays and further on being applied to industrial applications to lower the levels of CML on food content or a clinical approach to medical bioremediation.
A lo largo de los años, nuestro cuerpo tiende a acumular una gran variedad de pequeñas moléculas que son incapaces de ser metabolizadas o erradicadas de nuestro sistema. Al la concentración de estas moléculas aumentar, se comienzan a tener efectos negativos sobre la salud, que a menudo están relacionadas con una gran variedad de enfermedades asociadas al envejecimiento. Por ejemplo, La molécula derivada de los productos de glicación terminal avanzada conocida como Nε -(carboximetil)-Lisina (CML) desempeña un papel importante en el desarrollo de patologías secundarias asociadas con la diabetes. CML también se ha encontrado que puede inducir la esteatosis en el hígado graso no alcohólico. A pesar de que la producción de CML se puede inhibir mediante tratamiento, la molécula pequeña permanece presente en el tejido afectado y las proteínas reticuladas. Por lo tanto, el desarrollo de tratamientos enzimáticos que podrían eliminar sustancialmente los niveles de CML acumulado sería de gran beneficio para nuestra sociedad. Con el fin de encontrar un algún agente biocatalítico para CML, se ha implementado la metagenómica funcional, mediante análisis de asimilación en medio mínimo suplementado con CML. Un total de cuatro bibliotecas de metagenómicas fueron monitoreadas utilizando este método. Las mismas provenían de suelo del bosque subtropical lluvioso de El Yunque, del bosque seco de Guánica, y las restantes de los tapetes microbianos bentónicos y los efímeros de las salinas de Cabo Rojo. Un total de 178 clones fueron aislados de todas las bibliotecas. El estudio se centró en el clon RBI-3 clon proveniente de la biblioteca metagenómica de El Yunque. Un análisis de mutagénesis por transposición se realizó con el transposón Tn5 con el fin de generar mutantiones aleatorias que podrían desactivar la actividad. Cada mutante fue secuenciado usando secuenciación de Sanger. El clon por otro lado fue totalmente secuenciado utilizando la plataforma Mi-Seq de Illumina y ensamblado mediante ensamble 𝘥𝘦 𝘯𝘰𝘷𝘰 y ensamble híbrido entre Sanger e Illumina por ensamblaje de molde. Además se realizó una anotación automatizada por el sistema de anotación automático, RAST, mientras que las anotaciones manuales se realizaron para aquellos genes de interés cerca de los sitios de inserción del Tn5. Un total de cuatro genes candidatos se predijeron y fueron caracterizados mediante análisis filogenético de proteínas. El gen anotado como oxidasa de sulfito fue utilizado para una prueba de complementación genética 𝘪𝘯 𝘵𝘳𝘢𝘯𝘴. Como resultado, los datos experimentales demostraron que este gen está involucrado con la capacidad de 𝘌. 𝘤𝘰𝘭𝘪 EPI300 de utilizar CML como única fuente de carbono, restableciendo la habilidad perdida en el mutante. Estos hallazgos podrían conducir al desarrollo de ensayos 𝘪𝘯 𝘷𝘪𝘵𝘳𝘰 y al desarrollo de aplicaciones industriales para reducir los niveles de CML en los alimentos tanto como un enfoque clínico de bioremediación médica.
A lo largo de los años, nuestro cuerpo tiende a acumular una gran variedad de pequeñas moléculas que son incapaces de ser metabolizadas o erradicadas de nuestro sistema. Al la concentración de estas moléculas aumentar, se comienzan a tener efectos negativos sobre la salud, que a menudo están relacionadas con una gran variedad de enfermedades asociadas al envejecimiento. Por ejemplo, La molécula derivada de los productos de glicación terminal avanzada conocida como Nε -(carboximetil)-Lisina (CML) desempeña un papel importante en el desarrollo de patologías secundarias asociadas con la diabetes. CML también se ha encontrado que puede inducir la esteatosis en el hígado graso no alcohólico. A pesar de que la producción de CML se puede inhibir mediante tratamiento, la molécula pequeña permanece presente en el tejido afectado y las proteínas reticuladas. Por lo tanto, el desarrollo de tratamientos enzimáticos que podrían eliminar sustancialmente los niveles de CML acumulado sería de gran beneficio para nuestra sociedad. Con el fin de encontrar un algún agente biocatalítico para CML, se ha implementado la metagenómica funcional, mediante análisis de asimilación en medio mínimo suplementado con CML. Un total de cuatro bibliotecas de metagenómicas fueron monitoreadas utilizando este método. Las mismas provenían de suelo del bosque subtropical lluvioso de El Yunque, del bosque seco de Guánica, y las restantes de los tapetes microbianos bentónicos y los efímeros de las salinas de Cabo Rojo. Un total de 178 clones fueron aislados de todas las bibliotecas. El estudio se centró en el clon RBI-3 clon proveniente de la biblioteca metagenómica de El Yunque. Un análisis de mutagénesis por transposición se realizó con el transposón Tn5 con el fin de generar mutantiones aleatorias que podrían desactivar la actividad. Cada mutante fue secuenciado usando secuenciación de Sanger. El clon por otro lado fue totalmente secuenciado utilizando la plataforma Mi-Seq de Illumina y ensamblado mediante ensamble 𝘥𝘦 𝘯𝘰𝘷𝘰 y ensamble híbrido entre Sanger e Illumina por ensamblaje de molde. Además se realizó una anotación automatizada por el sistema de anotación automático, RAST, mientras que las anotaciones manuales se realizaron para aquellos genes de interés cerca de los sitios de inserción del Tn5. Un total de cuatro genes candidatos se predijeron y fueron caracterizados mediante análisis filogenético de proteínas. El gen anotado como oxidasa de sulfito fue utilizado para una prueba de complementación genética 𝘪𝘯 𝘵𝘳𝘢𝘯𝘴. Como resultado, los datos experimentales demostraron que este gen está involucrado con la capacidad de 𝘌. 𝘤𝘰𝘭𝘪 EPI300 de utilizar CML como única fuente de carbono, restableciendo la habilidad perdida en el mutante. Estos hallazgos podrían conducir al desarrollo de ensayos 𝘪𝘯 𝘷𝘪𝘵𝘳𝘰 y al desarrollo de aplicaciones industriales para reducir los niveles de CML en los alimentos tanto como un enfoque clínico de bioremediación médica.
Description
Date
2015