Towards the design of highly selective molecularly imprinted hydrogels for biosensor applications

Abstract

Robust molecular recognition is essential to enhance the accuracy of diagnostic devices aiming for a better efficacy in the clinical treatment of patients. The molecular imprinting technique has gained attention to generate novel biosensor and clinical diagnostic devices with high sensitivity and specificity, which demonstrated affinities compared to their natural counterparts. A method for the rational design of biomimetic sensors based on molecularly imprinted polymer for the detection of hydrocortisone is described and applied. The thermodynamic of the association between hydrocortisone and the functional monomer, methacrylic acid (MAA) was investigated by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Dissociation constants for the complex formation between hydrocortisone and a functional monomer analogue, acetic acid, as a function of solvent nature were estimated by NMR titration. The results demonstrate lower affinity using ethanol as solvent (K=0.5814 0.0.1163 M). However, the formation of adduct was confirmed, which suggested creation of MAA-Hydrocortisone at the pre-polymeric mixture. The stoichiometry of the complex formation between hydrocortisone and an acetic acid on each solvent was evaluated by the Job method of continuous variation. Dimethyl sulfoxide and ethanol were selected as porogens to assess solvent effect. The dissociation constants obtained for ethanol-d6 reflected a greater proximity of interaction between solution adducts compared to dimethyl sulfoxide-d6. It is consequently associated by the dielectric constant of the solvents. Job plot results suggested a complex mole ratio of 1.5:1 and 1:2 for dimethyl sulfoxide-d6 and ethanol-d6, respectively. The collective analysis of NMR titration and Job plot method indicated the extent of shift displacement is proportional to the proximity to the interaction site that is not apparently associated with its stoichiometric capabilities of complex formation. To evaluate synthesis condition, in situ free radical copolymerization was monitored by ATR-FTIR spectroscopy with methacrylic acid (MAA) as the functional monomer and tetra(ethylene glycol) dimethacrylate (TEGDMA) as the crosslinking agent in different solvents. The synthesis was performed in presence and absence of the template molecule. The combined set of analysis allowed a better understanding of the recognition events giving rise to the imprinting effect during MIP synthesis and to ligand-MIP binding events. In situ polymerization results demonstrated a delay of the auto-acceleration during the imprinting process. In essence, the propagation kinetic was reduced by the decrease of monomer mobility, which suggested the functional monomer-template complexation already confirmed by the NMR spectroscopic studies. Consequently, the information was to be applied for the design of thin films MIP. It can be for seen that using this information, the collapse-swelling transition of MIPs could be programmed to promote binding capabilities and enhance template diffusion. To these aims, hydrocortisone imprinted polymers were synthesized in aqueous media. The feasibility of hydrogel-based MIPs was evaluated by measuring equilibrium swelling, structural parameters (e.g. mesh size, ) and template permeation as function of pH and copolymer composition. The MIP characterization results demonstrated an increase of template permeation directly influenced by mesh size at pH equal to 5.5 at 37°C and ionic strength of 0.1M. A different behavior was shown for the characterization at pH equal to 6.0 at 37°C and ionic strength of 0.1M. A reduction was observed on the permeability coefficient for MIP with a MAA/EGDMA ratio of 17:1. It suggested the influence of MIP-ligand binding on hydrocortisone transport through the polymeric network synthesized by molecular imprinting technique based on the permeation reduction. In order to confirm this hypothesis, the binding constant (b) was estimated from the slope (15.17309 M-1) of linear regression of the Langmuir isotherm and the saturation capacity (qs = 0.09128) from its intercept (1.385). In addition, the hydrocortisone rebinding to 17:1 MIP was confirmed with the electroconductivity results of MIP 17:1, which demonstrated higher sensitivity toward hydrocortisone in comparison to non-MIP. Overall, this work reported the evaluation of the principal factors affecting the stabilization of functional monomer-template complex before and during the imprinting process, which provides essential information for the rational design of molecularly imprinted polymers. In addition, the sensitivity of imprinted gels confirmed the presence of binding sites.

El reconocimiento molecular es esencial para mejorar la precisión de equipos para el diagnóstico mejorando así la eficacia del tratamiento clínico de los pacientes. La técnica de impresión molecular ha ganado la atención para el desarrollo de biosensores y sistemas de diagnostico clínico. Los mismos se caracterizan por tener alta sensitividad y especificidad que demuestran tener afinidades comparables con los anticuerpos. El diseño racional de un biosensor basado en polímeros de impresión molecular es descrito y fue demostrado. La asociación termodinámica entre hidrocortisona y el monómero funcional ácido metacrílico fue investigada utilizando espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR). La constante de disociación para el complejo formado por hidrocortisona y el monómero análogo, ácido acético, como función de la naturaleza de solvente fue estimado por titilación de NMR. Los resultados demostraron menor afinidad al utilizar etanol como solvente (K=0.5814 0.0.1163/M). Aun así, los resultados sugieren es la formación de los complejos MAA-hidrocortisona en la solución pre-polimérica al utilizar etanol como solvente. Esto es favorable para utilizar etanol eventualmente para la síntesis de estos polímeros. La estequiometría de la formación del complejo se estimó con el método de variación continua. Los solventes evaluados fueron sulfóxido de dimetilo y etanol. La constante de disociación evaluada para etanol refleja menor proximidad entre los grupos funcionales durante la formación del complejo de MAAhidrocortisona. Los gráficos de Job sugieren la formación de los complejos cuya razón son de 2:1 y de 1:2 para sulfóxido de dimetilo y etanol, respectivamente. La evaluación de la síntesis de impresión molecular se efectuó monitoreando la polimerización por radical libre utilizando espectroscopia de infrarrojo. La polimerización de ácido metacrílico con dimetacrilato de glicol de etileno fue evaluada en varios solventes y en la presencia de la molécula modelo, hidrocortisona. La evaluación de los resultados demuestra un retraso en la autoaceleración con la presencia de la molécula modelo en la síntesis del polímero. Esto sugiere que el complejo se mantiene ya que la movilidad del monómero funcional (MAA) es reducida al estar interactuando con la molécula modelo (hidrocortisona) lo cual fue confirmado con los estudios de espectroscopia de resonancia magnética nuclear. Esta información fue utilizada para diseñar polímeros de impresión molecular de tipo capa fina programados para promover capacidades de enlace con la molécula modelo y de esta misma forma mejorar su difusión a través de la membrana. Con este propósito, se sintetizaron polímeros de impresión molecular para la detección de hidrocortisona en fase acuosa. Para evaluar la viabilidad de los polímeros, estos se caracterizaron para determinar su capacidad de hinchamiento, tamaño de poro ( ) y capacidad de permeabilidad como función de pH y composición del polímero. La caracterización de los polímeros de impresión molecular demostró que aumento en la permeabilidad de la molécula modelo el cual fue influenciado por el tamaño del poro y el ambiente químico observado a pH igual a 5.5 y 6.0 con fuerza iónica de 0.1 M. Por otro lado, un comportamiento diferente fue observado a pH 6.0. El coeficiente de permeabilidad se redujo al utilizar el polímero de impresión molecular con una razón de MAA/EGDMA de 17:1. Los resultados sugieren la influencia del enlace entre el ligando (hidrocortisona) y el polímero de impresión molecular en el transporte de hidrocortisona a través de la membrana. Esto debido a la creación de lugares de reconocimiento molecular luego de la síntesis utilizando la técnica de impresión molecular. Con el propósito de confirmar la hipótesis, la constante de enlace y la capacidad de saturación del polímero de impresión molecular 17:1 fueron estimadas realizando experimentos de enlaces. Los datos de estos experimentos fueron ajustados al modelo de Langmuir lineal para obtener de la pendiente la constante de enlace (15.17309 M-1) y del intercepto calcular la capacidad de saturación (0.09128). La hipótesis de que la permeabilidad se redujo debido a la interacción de hidrocortisona con el polímero de impresión molecular fue confirmada con las pruebas electroconductividad donde el polímero de impresión molecular 17:1 que demostraron mayor sensitividad a hidrocortisona al compararla con los polímeros de referencia. En conclusión, este trabajo reporta el avalúo de los principales factores que afectan la estabilización del complejo de MAA-hidrocortisona antes y durante la síntesis de impresión molecular. Esta información es vital para el diseño racional de polímeros de impresión molecular con el objetivo de mejorar su selectividad y sensitividad en fase acuosa.