Generation of large-insert metagenomic libraries from subtropical hypersaline microbial mats and their screening for antibiotic resistance

Abstract

Most of the microbial diversity in an environment cannot be studied through laboratory standard media culture methods. For this, an emerging science, coined “Metagenomics”, has been developed as an effort to access the majority of microorganisms. It involves the isolation and further characterization of microbial genomes and their study from different perspectives, using sequence-based and function-based analyses. Metagenomic studies of several environments (i.e. soil, water, animals, among others) have unraveled novel activities with industrial, biotechnological, and biomedical potential. Recently (during the last decade), unique environments such as microbial mats have also been subjected to metagenomic approaches. Microbial mats are organo-sedimentary structures found in extreme environments harboring highly metabolically diverse microorganisms. While macro and microscopic analyses as well as geomicrobiological studies have been performed with the microbial mats of Cabo Rojo Salterns, non-metagenomic studies were done to these ecosystems at that point. Our study presented the generation of large-insert metagenomic libraries from two subtropical hypersaline microbial mats (benthic and ephemeral) during the dry and rainy seasons. Also, due to the increase in antimicrobial resistant clinical isolates threatening human health, the metagenomic libraries were monitored by a functional-based analysis for the search of antibiotic resistance. Using an indirect extraction method, total DNA from microbial mats samples was isolated. DNA fragments of more than 20 Kbp were cloned into fosmids, packed in vitro and transduced into a host strain. Four metagenomic libraries were generated with a total of 64,600 clones with inserts ranging from 20-100 Kbp. The libraries were screened for resistance to ampicillin, tetracycline, spectinomycin, gentamicin and kanamycin. Only gentamicin and kanamycin resistant clones were isolated with inserts of approximately 30 Kbp and 40 Kbp, respectively. The restriction analysis and the retransformation of the fosmid into an isogenic strain confirmed the presence of an insert responsible for the resistance. The gentamicin resistant clone was mutagenized and further characterized by primer walking. The in silico analysis suggested the presence of five open reading frames from which two were related to antibiotic resistance genes. These included a 16S rRNA methyltransferase and an N-acetyltransferase most related (less than 40 % of identity with NCBI protein database) to Chloroflexus and uncultured prokaryote enzymes, respectively. Our data confirmed metagenomics as an emerging technology to unravel novel microbial strategies for biomedical application such as antibiotic resistance in environments as unique as microbial mats.

La mayoría de la diversidad microbiana en un ambiente no puede ser estudiada a través de métodos basados en medios de cultivo de laboratorio. Por esto, una ciencia emergente nombrada “Metagenómica” ha sido desarrollada para alcanzar a estudiar la mayoría de los microorganismos. Ésta involucra el aislamiento y la subsiguiente caracterización de genomas microbianos y su estudio desde diferentes perspectivas, utilizando análisis basados en secuencia y en función. Estudios metagenómicos de varios ambientes (suelo, agua, animales, entre otros) han descubierto actividades nuevas con potencial industrial, biotecnológico y biomédico. Recientemente (menos de una década), ambientes únicos como los tapetes microbianos también han sido sometido a estudios metagenómicos. Los tapetes microbianos son estructuras laminares órgano-sedimentarias que se encuentran en ambientes extremos y albergan microorganismos con una alta diversidad metabólica. Análisis macro y microscópicos así como estudios geomicrobiológicos se han llevado a cabo con los tapetes microbianos de las salinas de Cabo Rojo en Puerto Rico mientras que ningún estudio metagenómico de estos ecosistemas se había realizado hasta este momento. Nuestro estudio presenta la generación de bibliotecas metagenómicas de alto peso molecular de dos tapetes microbianos subtropicales hipersalinos (béntico y efímero) durante la época seca y lluviosa. También, debido al aumento en el número de aislados clínicos resistentes a antibióticos que amenaza la salud humana, las bibliotecas metagenómicas fueron utilizadas en un análisis basado en función para la búsqueda de resistencia a antibiótico. ADN total de los tapetes microbianos fue aislado utilizando un método indirecto de extracción. Fragmentos mayores de 20 Kpb fueron clonados en fósmidos, empacados in vitro y transducidos a una cepa bacteriana huésped. Cuatro bibliotecas metagenómicas fueron generadas para un total de 64,600 clones con insertos desde 20-100 Kpb. Las bibliotecas fueron utilizadas para buscar resistencia a ampicilina, tetraciclina, spectinomicina, gentamicina y kanamicina. Sólo clones resistentes a gentamicina y kanamicina fueron aislados con insertos de aproximadamente 40 Kpb y 30 Kpb, respectivamente. El análisis de restricción y la retransformación de de los fósmidos resistentes en una cepa isogénica confirmó la presencia de insertos responsables de los fenotipos de resistencia. Un clon resistente a gentamicina fue mutagenizado y luego caracterizado por “primer walking” y un análisis in silico. El análisis sugirió la presencia de cinco marcos de lectura abiertos de los cuales dos fueron relacionados con genes de resistencia a antibiótico. Éstos incluyen una 16S rRNA meiltransferasa y una N-acetyltransferasa más relacionadas (menos de 40% bde identidad con NCBI protein database) a Chloroflexus y un procariota no-cultivable, respectivamente. Nuestros datos confirman la metagenómica como una tecnología emergente para descubrir estrategias microbianas nuevas con aplicación biomédica como resistencia a antibiótico en ambientes tan únicos como los tapetes microbianos.