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In-line monitoring and controlling protein batch crystallization process using Raman spectroscopy
Mercado Cruz, Joanna
Mercado Cruz, Joanna
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Abstract
Protein crystallization as part of a new field of solid formulation becomes a challenging task for the pharmaceutical industries. Protein crystallization must occur without affecting the conformational structure of the protein. Factors such as temperature, pH, ionic strength, protein concentration and solvent can affect the final stages of protein crystallization. Monitoring and controlling the early stages of protein crystallization can provide useful information for a reliable experimental design of protein batch crystallization in large scale unit operations. In this study, Fiber Optic Raman Spectroscopy has been used to develop a Process Analytical Technology (PAT) based system to monitor and control the lysozyme protein crystallization process. Raman spectroscopy is a method that shows great potential in the monitoring of protein crystallization because water is a poor Raman scatterer. This analytical technique was used to investigate the vibrational behavior of the lysozyme protein under conditions promoting crystallization. Several Raman bands were affected by the lysozyme protein concentration, precipitant agent, temperature and time of crystallization. The relative intensities of the lysozyme protein bands increased when the lysozyme protein was in solution and decreased when the lysozyme crystal formed. A correlation between the conditions promoting crystallization (sodium chloride, temperature and time of crystallization) and the relative intensity of the lysozyme protein was established using Multiple Linear Regression (MLR). The region of 2940 cm⁻¹ and the ratio between the regions of 760 cm⁻¹/750 cm⁻¹ presented the highest correlation between the R² and Q². These regions correspond to the C-H stretching and the aromatic ring vibrational mode of tryptophan. The solubility limit, metastable zone, and supersaturated zone were established using the contour plots map of these two regions. Polarized Light Microscopy (PLM) revealed that the crystal habit, crystal size distribution and the morphology of the lysozyme protein crystal were affected by the temperature and the amount of sodium chloride.
La cristalización de proteínas como parte de un nuevo campo de formulación sólida ha sido una tarea difícil para las industrias farmacéuticas. Este proceso debe ocurrir sin afectar la estructura conformacional de la proteína. Factores tales como la temperatura, pH, fortaleza iónica, concentración de la proteína y del solvente pueden afectar los pasos finales de la cristalización de la proteína. El monitorear y controlar las etapas tempranas de la cristalización de proteínas puede proveer información útil para un diseño experimental fiable para la cristalización de proteína en unidades de operación a grandes escalas. En este estudio, Espectroscopia de Raman con Fibra óptica ha sido utilizada para el desarrollo de un sistema basado en Proceso Analítico Tecnológico (PAT) para monitorear y controlar los procesos de cristalización de la proteína lisozima. La Espectroscopia de Raman es un método potencial para monitorear proteínas en solución acuosa por que el agua poca dispersión por Raman. Esta técnica analítica fue utilizada para investigar el comportamiento vibracional de la proteína de lisozima bajo condiciones promotoras de cristalización. Un número de bandas de Raman fueron afectadas por la concentración de la proteína de lisozima, el agente precipitante, la temperatura y el tiempo de cristalización. Las intensidades relativas de las bandas de la proteína de lisozima aumentaron cuando la proteína de lisozima estaba en solución y disminuyeron cuando se formaron los cristales de lisozima. Una correlación entre las condiciones promotoras de cristalización (cloruro de sodio, temperatura y tiempo) y las intensidades relativas de la proteína de lisozima fueron establecidas utilizando Regresión Linear Multiple (RLM). La región de 2940 cm⁻¹ y la razón entre las regiones de 760 cm⁻¹/750 cm⁻¹ presentaron la correlación más alta entre R² y Q². Estas regiones corresponden al estiramiento de C-H y al modo vibracional del anillo aromático del triptófano. El límite de solubilidad, zona meta estable, y la zona supersaturada fueron establecidos utilizando los mapas de contorno de estas dos regiones. La Microscopía de Luz Polarizada (MLP) reveló que el hábito cristalino, la distribución del tamaño del cristal y la morfología del cristal de la proteína de lisozima fueros afectados por la temperatura y la cantidad de cloruro de sodio.
La cristalización de proteínas como parte de un nuevo campo de formulación sólida ha sido una tarea difícil para las industrias farmacéuticas. Este proceso debe ocurrir sin afectar la estructura conformacional de la proteína. Factores tales como la temperatura, pH, fortaleza iónica, concentración de la proteína y del solvente pueden afectar los pasos finales de la cristalización de la proteína. El monitorear y controlar las etapas tempranas de la cristalización de proteínas puede proveer información útil para un diseño experimental fiable para la cristalización de proteína en unidades de operación a grandes escalas. En este estudio, Espectroscopia de Raman con Fibra óptica ha sido utilizada para el desarrollo de un sistema basado en Proceso Analítico Tecnológico (PAT) para monitorear y controlar los procesos de cristalización de la proteína lisozima. La Espectroscopia de Raman es un método potencial para monitorear proteínas en solución acuosa por que el agua poca dispersión por Raman. Esta técnica analítica fue utilizada para investigar el comportamiento vibracional de la proteína de lisozima bajo condiciones promotoras de cristalización. Un número de bandas de Raman fueron afectadas por la concentración de la proteína de lisozima, el agente precipitante, la temperatura y el tiempo de cristalización. Las intensidades relativas de las bandas de la proteína de lisozima aumentaron cuando la proteína de lisozima estaba en solución y disminuyeron cuando se formaron los cristales de lisozima. Una correlación entre las condiciones promotoras de cristalización (cloruro de sodio, temperatura y tiempo) y las intensidades relativas de la proteína de lisozima fueron establecidas utilizando Regresión Linear Multiple (RLM). La región de 2940 cm⁻¹ y la razón entre las regiones de 760 cm⁻¹/750 cm⁻¹ presentaron la correlación más alta entre R² y Q². Estas regiones corresponden al estiramiento de C-H y al modo vibracional del anillo aromático del triptófano. El límite de solubilidad, zona meta estable, y la zona supersaturada fueron establecidos utilizando los mapas de contorno de estas dos regiones. La Microscopía de Luz Polarizada (MLP) reveló que el hábito cristalino, la distribución del tamaño del cristal y la morfología del cristal de la proteína de lisozima fueros afectados por la temperatura y la cantidad de cloruro de sodio.
Description
Date
2007