Sulfheme formation mechanism and spectra analysis using QM/MM and TDDFT

Abstract

Since the 1863 discovery of a new green hemoglobin derivative called “sulfhemoglobin”, the nature of its characteristic 618 nm absorption band and formation mechanism has been the subject of several hypotheses. Many heme-containing proteins with a histidine in the distal E7 (HisE7) position can form sulfheme in the presence of hydrogen sulfide (H2S) and a reactive oxygen species such as hydrogen peroxide. For unknown reasons, sulfheme derivatives are formed specifically on the solventexcluded heme pyrrole B. Here, the use of hybrid Quantum Mechanical/Molecular Mechanical (QM/MM) methods have permitted characterization of the entire process of sulfheme formation in the HisE7 mutant of hemoglobin I (HbI) from Lucina pectinata. This process includes a mechanism for H2S to enter the solvent excluded active site through a hydrophobic channel to ultimately form a hydrogen bond with H2O2 bound to Fe(III). Proton transfer from H2O2 to His64 to form Compound (Cpd) 0 followed by hydrogen transfer from H2S to Fe(III)-H2O2 complex results in homolytic cleavage of the O-O and S-H bond to form a reactive thiyl radical (HS•), ferryl heme compound II (Cpd II) and a water molecule. Subsequently, HS• addition to Cpd II followed by three proton transfer reactions results in the formation of a 3-membered ring ferric sulfheme (SA) that avoids the migration of the radical to the protein matrix in contrast to other peroxidative reactions. The transformation of SA to the 5-membered thiochlorin ring structure (SC) occurs through a significant potential energy barrier though both structures are nearly isoenergetic. Both SA and SC reveal a longer NB--Fe(III) bond than the other pyrrole nitrogen--Fe(III) bonds which would lead to a decreased in oxygen binding. The sulfheme experimental spectra are a function of the observation time, and interplay between two major sulfheme isomer concentrations (SA and SC); the latter being the dominant isomer at longer times. Thus, timedependent density functional theory (TDDFT) was used to calculate the sulfheme excited states and visualize the highest occupied molecular orbitals (HOMOs) and lowest unoccupied MOs (LUMOs) of both isomers in order to interpret the transitions between them. Formation of the three-membered ring SA and SC isomeric structures decrease the energy of the HOMO a1u and a2u orbitals compared to the unmodified heme due to the electron-withdrawing sulfur-containing ring. The calculations reveal that the absorption spectrum within the 700 nm region arises from a mixture of MOs, but can be characterized as π to π* transitions, while the 600 nm region is characterized by π to dπ (dyz, dxz) transitions having components of a deoxy like derivative. Overall, these results are in agreement with a wide range of experimental data and provide fertile ground for further investigations of sulfheme formation in other heme proteins, and additional effects of H2S on cell signaling and reactivity.

Desde el descubrimiento en 1863 de un nuevo derivado de hemoglobina de color verde llamado "sulfhemoglobina", la naturaleza de la banda característica de absorción a 618 nm y el mecanismo de formación ha sido objeto de varias hipótesis. Muchas hemo proteínas con histidina en la posición distal E7 (HisE7) pueden formar sulfhemoglobina al estas reacionar con una especie de oxígeno reactivo tal como peróxido de hidrógeno en presencia de sulfuro de hidrógeno (H2S). Por razones desconocidas, la modificación al grupo hemo al formarse sulfhemoglobina ocurre específicamente en el pirrol B, el cual está dentro de la matriz proteica fuera del contacto con el solvente. En este trabajo se usaron métodos híbridos Mecánicos Cuánticos / Mecánicos Moleculares (QM / MM) que han permitido la caracterización del proceso de formación de sulfhemoglobina en el mutante HisE7 de hemoglobina I (HbI) de Lucina pectinata. Se encontró un mecanismo para que el H2S ingrese al sitio activo a través de un canal hidrofóbico, para finalmente formar un enlace de hidrógeno con H2O2 unido al Fe (III). Una transferencia de protones de H2O2 a His64 para formar el Compuesto (Cpd) 0 seguido de transferencia de hidrógeno del complejo H2S al Cpd 0 da como resultado la escisión homolítica del enlace O-O y SH para formar un radical reactivo de tiílo (HS•), compuesto II (Cpd II) y una molécula de agua. Posteriormente, la adición de HS• a Cpd II seguida por tres reacciones de transferencia de protones da como resultado la formación del isómero de 3 miembros de sulfhemoglobina (SA). Este mecanismo evita la migración del radical generado a la matriz proteica lo cual contrasta con otras reacciones peroxidativas. La transformación de esta estructura de SA a una estructura de anillo de tioclorina de 5 miembros (SC) se produce a través de una barrera de energía potencial significativa, aunque ambas estructuras son casi isoenergéticas. Ambos isómeros revelan un enlace NB - Fe (III) más largo que el observado para los otros enlaces de nitrógeno a Fe (III) lo que podría explicar la redución de afinidad con oxígeno de sulfhemoglobina comparado con la afinidad por oxígeno de hemoglobina. Los espectros experimentales de sulfhemoglobina dependen del tiempo de observación y la interacción entre las concentraciones de sus principales isómeros (SA y SC); siendo este último el isómero dominante en tiempos más largos. Por lo tanto, se usó la teoría de funcional de densidad dependiente del tiempo (TDDFT) para calcular los estados excitados de sulfhemo y visualizar los orbitales moleculares ocupados de más alta energía (HOMO) y los orbitales moleculares (MO) desocupados de más baja energía (LUMO) de ambos isómeros para interpretar las transiciones de ellos. La formación de los isoméros SA y SC disminuyen la energía de los orbitales HOMO a1u y a2u en comparación con el hemo. Los cálculos revelan que el espectro de absorción dentro de la región de 700 nm surge de una mezcla de MO, pero se puede caracterizar como transiciones π a π*, mientras que la región de 600 nm se caracteriza por transiciones de π a dπ (dyz, dxz). En general, estos resultados están de acuerdo con una amplia gama de datos experimentales y proporcionan un terreno fértil para investigaciones adicionales en la formación de sulfhemo en otras hemo proteínas, y los efectos adicionales de la reactividad y la señalización celular de H2S.