Development of a culture substrate for the scale-up expansion of human Mesenchymal stromal cells for therapeutic applications

Abstract

The cell manufacturing field is constantly growing, each time promoting new and better cell fabrication strategies to allow the arrival of the widely expected Mesenchymal stromal cells’ (MSCs) based cell therapies to reach the US market. This work has devoted a significant effort to generating and characterizing new cell culture strategies using the layer-by-layer (LbL) technique to produce polymeric coatings for the expansion of MSCs. It has also studied the effects of used materials on cell responses at the adhesion level, growth, proliferation, survival, senescence, immunomodulation, and surface remodeling. As an initial measure, we generated layers composed of Heparin and Collagen (HEP/COL) and showed that they were physically and chemically stable for up to 30 days at room temperature. In addition, there was proven that multilayers promoted substantial improvements in cell expansion and secretion of soluble factors, even under reduced serum conditions. Afterward, evaluations were carried out at the molecular level exploring the role of integrin-matrix interactions in the LbL-deposited coatings, confirming an effect on cell adhesion through α2β1 integrins, which is linked to cell survival via the FAK/ERK activation cascade. Finally, multilayers were created using COL and various recombinant forms of Heparan Sulfate (rHS/COL), identifying significant differences in protein release profiles in response to inherent sulfation degrees, as well as improvements in cell proliferation, evaluated both in planar and microcarriers culture systems under serum-free conditions. This dissertation demonstrates that the polymeric formations of HEP/COL and rHSs/COL generated by the LbL method have great potential for MSC expansion, generating new opportunities for the cell manufacturing field.

El área de la manufactura de células se encuentra en constante crecimiento, promoviendo cada vez más nuevas estrategias de fabricación que permitan la llegada al mercado americano de las tan esperadas terapias celulares basadas en células mesenquimales humanas (MSCs). Este trabajo ha dedicado un esfuerzo significativo en la generación y caracterización de nuevas estrategias de cultivo celular usando la técnica de capa por capa (LbL) para promover la expansión de MSCs estudiando los efectos de los materiales usados en las respuestas celulares a nivel de adhesión, crecimiento, proliferación, supervivencia, senescencia, inmunomodulación y remodelación de las superficies. Como medida inicial generamos capas compuestas de Heparina y Colágeno (HEP/COL) demostrando en ellas una estabilidad estructural de hasta 30 días. A la vez que mejoras sustanciales inducidas en la expansión celular y secreción de factores solubles, incluso bajo condiciones de suero reducidas. Posteriormente, se llevaron a cabo evaluaciones a nivel molecular explorando el rol de las interacciones integrina-matriz en las capas depositadas por LbL, constatando un efecto en adhesión celular mediado por integrinas α2β1 y directamente ligado a la y supervivencia de las células a través de la cascada de activación FAK/ERK. Finalmente, se elaboraron capas empleando COL y distintas versiones recombinantes de Sulfato de Heparán (rHS/COL), encontrando diferencias significativas en los perfiles de liberación de proteínas asociados a los grados de sulfatación inherentes, así como también mejorías en la proliferación celular, evaluadas incluso en sistemas de cultivo de microportadores bajo condiciones libres de suero. Esta disertación demuestra que las formaciones poliméricas de HEP/COL and rHSs/COL generadas por la técnica de LbL tienen un gran potencial para la expansión de MSCs generando nuevas oportunidades para el área de la manufactura de células.