Assessment of the stability and biological activity of our model proteins encapsulated in hydrogel membranes

Abstract

Proteins are biological macromolecules which have a unique spatial conformation. This spatial conformation can be affected by extremes in pH, temperature, and organic solvents. Once this 3D spatial conformation is affected the protein’s biological stability and activity can be severely limited. For these reasons, this investigation focuses on the effects of pre-polymeric solution components on the behavior of proteins to be encapsulated by the entrapment technique in anionic, cationic, and neutral hydrogel membranes. Five proteins were utilized in this investigation: equine skeletal muscle myoglobin (MMb), equine heart myoglobin (HMb), bovine hemoglobin (bHb), porcine hemoglobin (pHb), and hen egg white lysozyme (HEWL). Three hydrogel morphologies were examined: methacrylic acid-poly(ethylene glycol) dimethacrylate (n=1000) (MAA:PEGDMA1000), dimethylaminoethyl methacrylate-poly(ethylene glycol) dimethacrylate (n=1000) (DMAEM:PEGDMA1000), and poly(ethylene glycol) (200) monomethyl ether-methacrylate-poly(ethylene glycol) dimethacrylate (n=1000) (PEGMA200:PEGDMA1000). The four hemeproteins were put in contact with different ratios of the pre-polymeric solution components. UV-vis spectroscopy was utilized to monitor displacements in the Soret Bands to determine any changes in biological stability. Optimized morphologies were then synthesized. The Soret bands of the proteins in the pre-polymeric solution were at the expected wavelengths ( = 408 (Mb), 406 (Hb)). Yet, upon polymerization, the Soret bands of the encapsulated proteins in ionic morphologies suffered blue shifts. Soret bands of the metaquo, deoxy, and carboxy states were all blue-shifted. Such phenomenon may be attributed to the breakage of the histidine-iron bond. Examination of the results revealed possible coexistence of metaquo/oxy and carboxy/oxy states within the polymerized membranes. Small displacements of the Soret bands upon changes from deoxy to carboxy states possibly expose higher affinity of CO to the polymer than to the heme group. HEWL crystals were exposed to pre-polymeric solutions of MAA:PEGDMA1000. Microscopy revealed that HEWL crystals were stable in these solutions for several hours. These morphologies will be polymerized in presence of HEWL crystals to investigate if crystals endure the polymerization process.

Las proteínas son macromoléculas biológicas que tienen una conformación espacial única. Esta conformación especial se ve afectada por extremos en pH, extremos en temperatura y la presencia de solventes orgánicos en el medio donde éstas se encuentran. Una vez este arreglo tridimensional cambia, la estabilidad y la actividad biológica de las proteínas se afectan severamente. Por estas razones, esta investigación se enfoca en los efectos de los componentes de la solución pre-polimérica en el comportamiento de las proteínas a ser encapsuladas en membranas de hidrogeles aniónicas, catiónicas y neutrales por la técnica de atropamiento. Cinco proteínas se utilizaron para estos estudios: mioglobina de músculo esqueletal de caballo (mMb), mioglobina de músculo cardíaco de caballo (hMb), hemoglobina bovina (bHb), hemoglobina porcina (pHb) y lisozima de clara de huevo de gallina (HEWL). Se examinaron tres morfologías de hidrogeles: ácido metacrílico-glicol de polietileno dimetacrilato (n=1000) (MAA:PEGDMA1000), dimetilamino etil metacrilato-glicol de polietileno dimetacrilato (n=1000) (DMAEM:PEGDMA1000) y glicol de polietileno (200) monometil eter metacrilato- glicol de polietileno dimetacrilato (n=1000) (PEGMA200:PEGDMA1000). Las cuatro hemo-proteínas estuvieron en contacto con diferentes razones de los componentes de las soluciones pre-poliméricas anteriores. Se utilizó la técnica de espectroscopia de luz ultra violeta visible para observar los desplazamientos de las bandas Soret y Q de las proteínas para determinar si hubo cambios en la estabilidad biológica de las proteínas. Luego, las morfologías optimizadas fueron sintetizadas. Las bandas Soret de las proteínas en las soluciones pre-poliméricas se encontraron en los largos de onda esperados (Mb - 408nm y Hb - 406nm). Aun así, luego de la polimerización, las proteínas encapsuladas en las morfologías iónicas sufrieron desplazamientos azules de sus bandas Soret. Este fenómeno puede atribuirse al rompimiento del uno de los enlaces hierro-histidina. Estas mismas bandas en los estados metaquo, deoxy y carboxy también sufrieron desplazamientos azules. Estos resultados se pueden atribuir a la coexistencia de estados metaquo/oxy y carboxy/oxy dentro de las membranas. Los desplazamientos pequeños que se observan al cambiar de estado deoxy a carboxy en las proteinas encapsuladas en las membranas de PEGMA200 pueden ser causados por una posible afinidad más alta del PEG al CO que del grupo hemo al CO. Cristales de HEWL fueron expuestos a soluciones pre-poliméricas de MAA:PEGDMA1000. Se observó, utilizando la técnica de espectroscopia de luz, que estos cristales fueron estables en estas soluciones por varias horas. Estas morfologías se sintetizarán en presencia de cristales de HEWL para investigar si los cristales sobreviven al proceso de polimerización.