Replication efficiency of the LuIII Parvovirus miinigenomes 3’LUIII3’ and 3’LUIII5’

Abstract

Parvoviruses are currently being studied for use as possible genetic vectors in gene therapy. They are small, non-enveloped viruses of icosahedral structure, and possess a single-stranded DNA genome of approximately 5,000 base pairs that replicate only during the S-phase of the host cell. The viral replication strategy resembles the rolling circle replication model requiring the viral protein NS1. This protein functions as a site specific DNA binding protein, thus, binding the viral origin and initiating self-replication process. Studies have shown that genetic constructs with two viral terminal palindromic structures are sufficient for autonomous replication of the molecule in the presence of NS1. To compare the replication of a minigenome containing two left termini with that of one containing a left and right palindrome of LuIII the DsRed gene from the pCMV-DsRed (Clontech) was inserted between the hairpins of both vectors. The red fluorescent protein (DsRed) allowed monitoring of the replication of these constructs. The results show that LuIII 3'-DsRed-3’ and LuIII 3'-DsRed-5’ were both capable of expressing fluorescence in the cells over time, thus, indicating that both recombinant plasmids were capable of self replication. The results also suggest that replication of LuIII 3'-DsRed-3’ was more efficient than LuIII 3'- DsRed-5’. This result suggests that a LuIII genetic vector containing two copies of the 3’ hairpin (identical palindromic sequences) may be more efficient than a vector containing the LuIII 3’ and 5’ palindromes. This research has been helpful in providing insight about the replication efficiency expected, based on the response of the 3’ and 5’ terminal hairpin arrangements in genetic vectors used in gene therapy.

Los parvovirus están siendo estudiados actualmente como posibles vectores genéticos en la terapia genética. Estos virus son pequeños, sin envoltura, con estructura icosahedral y poseen un genoma de ADN de cadena simple de aproximadamente 5,000 pares de bases que se replica sólo durante la fase S de la célula hospedera. La replicación de los parvovirus se asemeja al modelo circular de replicación el cual requiere la asistencia de la proteína NS1. Esta proteína se enlaza de manera específica al origen de replicación e inicia el proceso de replicación. Los estudios han demostrado que las construcciones genéticas con dos terminales palindrómicos virales son suficientes para la replicación autónoma de la molécula en la presencia de NS1. Para comparar la replicación de un minigenoma que contiene dos palindromes izquierdos con otro que contiene un palíndrome izquierdo y otro derecho de LuIII y el gen de DsRed de pCMV-DsRed (Clontech) se insertó entre los terminales en ambos vectores. La proteína fluorescente roja (DsRed) nos permitió el monitoreo de la replicación en estas construcciones. Los resultados mostraron que LuIII 3’-DsRed-3’ y LuIII 3’-DsRed-5’ son capaces de inducir fluorescencia en las células con respecto al tiempo, indicando así que ambos plásmidos recombinantes fueron capases de auto-replicación. Los resultados también sugieren que LuIII 3’- DsRed-3’ tienen una mejor eficiencia de replicación que LuIII 3’-DsRed-5’. Estos resultados sugieren que de construirse un vector genético del parvovirus LuIII éste seria más eficiente si tiene dos copias del terminal 3’ (secuencias palindrómicas idénticas). Esta investigación ha sido útil para proporcionar una visión sobre la eficiencia de replicación esperada, basada a la respuesta de los terminales 3 'y 5' en vectores genéticos utilizados en la terapia génica.