Detection and analysis of antimicrobial agents using metagenomic libraries generated from aquatic bodies of Puerto Rico

Abstract

Antimicrobials have been used for hundreds of years, being effective in the reduction and complete control of microbial growth. Increasing incidences of antimicrobial resistance (AR) has been observed globally. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Staphylococcus aureus are some of the microorganisms that have shown resistance to one antibiotic in the 50% of the cases reported by the World Health Organization. In spite of the antimicrobial resistance increases, the number of novel antimicrobial agents that have been discovered or developed has decreased. Antibiotics rediscovery is approximately 99.9%. Knowing that emerging disciplines such as metagenomics have become effective in understanding AR and in the discovery of molecules with antimicrobial activity, we sought in this study to find antibiosis as well as genes involved in antimicrobial activity in aquatic metagenomic libraries (AMLs). To reach this goal, samples from the water reservoir Lago Guajataca (GWR), the river Río Grande de Añasco (RGA), and the beach Playuela (PB) at Puerto Rico, were analyzed using culture dependent and independent approaches. Among them, an antibiosis assay for cultivable microorganisms, in which no antimicrobial production in any of the sampling sites was observed. A total of four high molecular weight AMLs were generated. Two were generated from two different sites at GWR; AML from sampling site 1 in GWR had approximately 2,500,000 clones with a 75% of DNA insert, while library from sampling site 2 had approximately 3,000,000 clones with 100% DNA insert. The AMLs from RGA and PB had approximately 87,000 clones and 1,500 clones, with an average of 70% and 80% of DNA insert, respectively. These libraries were screened for functional antimicrobial agents production by a modified Kirby-Bauer method and double-layer agar assay. Also, the libraries were screened to identify gene(s) associated with antimicrobial production using PCR specific primers for polyketide synthases (PKSs) and analyzed by in silico tools. Functional analysis revealed antimicrobial agents production against Klebsiella pneumoniae, Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus by the AMLs. Meanwhile, PKSs similar to those in Tolypothrix sp., Anabaena sp., Oscillatoria sp., Streptomyces sp., Kutzneria sp., Aspergillus sp., Sorangium sp., Shigella sp., Enterobacter sp., Vibrio sp., Tistrella sp., and Salinispora sp. were found; the majority of these genera were producers of antimicrobial agents. The in silico analysis at amino acid level showed the presence of sequences with homology to enzymes such as hybrids PKS/NRPS, transposases, synthases, and hypothetical proteins; some of them being related to antibiotic production as well as other biological activities. Therefore, the set of approaches taken to screen AMLs for antimicrobial agents production suggested that they were present in the studied environments and probably are polyketides. These findings represent an alternative to understand the distribution of genes with antimicrobial activity in aquatic bodies, as well as their prevalence. Beyond that, the data will help in the discovery or development of novel antimicrobials with the potential to reduce the AR global issue.

Los agentes antimicrobiales han sido utilizados por cientos de años, siendo efectivos en la reducción y control por completo del crecimiento microbiano. Se ha observado un incremento en las incidencias de resistencia a antimicrobiales (RA) a nivel mundial. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Staphylococcus aureus son algunos de los microorganismos que han mostrado ser resistentes a al menos un antibiótico en el 50% de los casos reportados por la Organización Mundial de la Salud. Por su parte, mientras incrementa la resistencia a antimicrobiales, el número de agentes antimicrobiales que se descubren o se desarrollan anualmente ha disminuido. El redescubrimiento de antibióticos es aproximadamente 99.9%. Conociendo del éxito de disciplinas emergentes como la metagenómica en el entendimiento de la resistencia a antimicrobiales, así como en el descubrimiento de moléculas con actividad antimicrobiana, se pretendió con esta investigación encontrar actividad y genes que estuvieran involucrados en antibiosis mediante el discernimiento de bibliotecas metagenómicas acuáticas (BMA). Para lograr esto, se colectaron muestras del Lago Guajataca (GWR), el Río Grande de Añasco (RGA) y la playa Playuela (PB) en Puerto Rico, las cuales fueron estudiadas usando métodos dependientes e independientes de cultivo. Entre ellos, un ensayo de antibiosis para microorganismos cultivables, en el cual ninguno de los ambientes analizados mostró producción de agentes antimicrobiales. Cuatro BMA de alto peso molecular fueron generadas. Dos de ellas fueron generadas de dos puntos diferentes de muestreo de GWR, la biblioteca generada del primer punto de muestreo tuvo aproximadamente 2,500,000 clones con un porcentaje de inserto de DNA de 75%, mientras que la generada del segundo punto de muestreo contiene aproximadamente 3,000,000 de clones y un 100% de inserto de DNA. Las bibliotecas de RGA y PB tuvieron aproximadamente 87,000 clones y 1,500 clones, respectivamente con un promedio de 70% y 80% de inserto de DNA. Luego de ser generadas, las bibliotecas fueron discernidas para la producción de agentes antimicrobiales mediante una versión modificada del ensayo de Kirby-Bauer y un ensayo de agar de doble-capa. Además, se discernieron las bibliotecas para identificar los genes asociados con la producción de antimicrobiales utilizando PCR con iniciadores específicos para las sintasas de policétidos (SP), y la identidad de éstos fue analizada usando herramientas in silico. El análisis funcional reveló que las BMA produjeron agentes antimicrobiales contra Klebsiella pneumoniae, Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus. Además, se encontraron sintasas de policétidos similares a las que se encuentran en los géneros de Tolypothrix sp., Anabaena sp., Oscillatoria sp., Streptomyces sp., Kutzneria sp., Aspergillus sp., Sorangium sp., Shigella sp., Enterobacter sp., Vibrio sp., Tistrella sp., y Salinispora sp. El análisis in silico a nivel de amino ácidos mostró la presencia de secuencias homólogas a enzimas tales como híbridos de PKS/NRPS, transposasas, sintasas y proteínas hipotéticas, de las cuales algunas están relacionadas a la producción de antibióticos así como a otras actividades biológicas. Por ende, el conjunto de métodos utilizados para detectar la producción de agentes antimicrobiales en las BMA sugiere que en los ambientes estudiados existen éstos agentes y que probablemente sean catalogados como policétidos. Estos hallazgos representan una alternativa para entender la distribución de genes con actividad antimicrobiana en cuerpos acuáticos, así como también su prevalencia. Más allá de eso, estos datos contribuyen al descubrimiento o desarrollo de antimicrobiales noveles con el potencial de reducir la problemática mundial de la resistencia a antimicrobiales.