Expression, isolation, purification, and characterization of recombinant human SFi1p1-2

Abstract

Homo sapiens Sfi1 (Hs Sfi1) is a 1242 amino acid protein containing 23 tandem binding sites for a calcium binding protein known as centrin. Hs Sfi1p₁₋₂ is an 8,592 Da peptide that corresponds to the first two centrin binding sites (CBS) within Hs Sfi1. Both proteins are constituents of contractile fibers in the centrosome and play essential roles in centriole duplication and separation. The objectives of this work were to: express, isolate, purify, and biochemically characterize recombinant Hs Sfi1p₁₋₂. A bacterial stock culture of Escherichia coli BL21-(DE3) RIL was transformed with pET 100 expression vector containing His tagged-Hs Sfi1p₁₋₂. His tagged-Hs Sfi1p₁₋₂ recombinant peptide has a molecular weight of 12,119 Da. The bacterial stock was grown in a five liter bench scale fermentor up to log phase and induced with isopropyl-β-thiogalactoside (IPTG). Following the successful expression of recombinant His-Hs Sfi1p1-2, the supernatant was subjected to His-tag affinity and anion exchange chromatography and a band was observed near the expected molecular weight of ~12 kDa by 4-20% (Bis-Tris) gradient SDS-PAGE. However, based on the elution pattern and UV/Vis analysis it was suspected that the recombinant peptide stayed in the pellet. An alternative isolation process was performed by an extraction method with organic solvents using CHCl₃:CH3OH (2:1, v/v) extraction followed by a CHCl₃:CH3OH (1:1, v/v) volume ratios. A 4-20% (Bis-Tris) gradient SDSPAGE revealed the presence of a protein with similar molecular weight in both the aqueous and the organic phases. Partial amino acid sequencing confirmed the presence of Hs Sfi1p1-2 to be in the aqueous phase of the extraction. Alternate purification step involved subjecting the protein sample to size exclusion chromatography.

Homo sapiens Sfi1 (Hs Sfi1) es una proteína de 1242 amino ácidos que contiene 23 lugares de enlace para la proteína enlazante de calcio centrin. Hs Sfi1p1-2 es un péptido con un peso molecular de 8,592 Da que corresponde a los primeros dos lugares de enlace de centrin, dentro de Hs Sfi1. Ambas proteínas forman parte de las fibras contráctiles en el centrosoma y poseen un rol esencial en la separación y duplicación del centriolo. Los objetivos de este trabajo lo fueron: expresar, aislar, purificar y caracterizar el péptido recombinante Hs Sfi1p1-2. Un cultivo bacteriano de Escherichia coli BL21-(DE3) RIL fué transformado con el vector de expresión pET 100 que contenía la secuencia de His-Hs Sfi1p1-2. El péptido recombinante His-Hs Sfi1p1-2 posee un peso molecular de 12,119 Da. Las células transformadas fueron crecidas en un fermentador de cinco litros hasta alcanzar la fase log e inducidas mediante la adición de isopropil-β-tiogalactosidasa (IPTG). Luego de la exitosa expresión de His-Hs Sfi1p1-2, el sobrenadante fue sometido a cromatografía de afinidad por el contenido en su secuencia de histidinas y cromatografía de intercambio aniónico, en donde una banda pura con el peso molecular esperado fue observada por la técnica de SDS-PAGE (por sus siglas en inglés). Luego de analizar los patrones de elución y la absorción en la región espectral ultravioleta, se comenzó a sospechar que Hs Sfi1p1-2 estaba permaneciendo en el precipitado de la centrifugación. Un procedimiento alternativo de aislación se realizó mediante extracción por solventes orgánicos utilizando CHCl₃:CH3OH (2:1, v/v) seguido de otra extracción CHCl₃:CH3OH (1:1, v/v) razones por volumen. La técnica de gradiente 4-20% (Bis-Tris) SDS-PAGE reveló la presencia de una proteína con peso molecular similar (~12 kDa) para ambas fases: la acuosa y orgánica y la técnica de secuenciación parcial de amino ácido reveló la presencia de Hs Sfi1p1-2 en la fase acuosa de la extracción. La estrategia de purificación alterna consistió en utilizar cromatografía por exclusión de tamaño.