Expression and purification of Lucina pectinata recombinant hemoglobin II and the effect of the oxygen affinity on the heme pocket

Abstract

Lucina pectinata is a bivalve mollusk that inhabits sulfide rich sediments along, the west coast of Puerto Rico. This clam contains three hemoglobins that deliver and transport oxygen (HbII and III) and hydrogen sulfide (HbI) to chemoautotrophic bacteria. The HbII is an oxygen reactive protein in which the oxygen is anchored to the heme through H-bonds with Tyr30 (B10) and Gln65 (E7) being responsible for the extremely low oxygen dissociation rate (0.11 s-1 ). A previous experiment showed that HbII is resistant to H2O2 and NO oxidation characteristics useful for the development of oxygen carrier derivatives. However, it is necessary to improve oxygen binding and induce allosteric properties of HbII. This was achieved through site-directed mutagenesis of HbII. Here, we report that recombinant HbII (rHbII) expression in bacteria was obtained after induction in a time course of 3-4 hours and the maximum rHbII protein yield obtained was 134.72 mg/L using the pET28 expression vector transformed in BLi5 cells. The optimal expression condition occurred when the induction was performed at 30 °C and when the terrific broth medium was supplemented with 1 mM IPTG and 60 µg/mL hemin chloride. To monitor the expression, we extracted the proteins and purified the rHbII using a metal resin. The protein product was analyzed using UV-Vis spectroscopy; the concentration of rHbII protein was determined using the molar extinction coefficient of 129 mM-1 cm-1 at 414 nm for the oxy-rHbII. Functional characterization of the rHbII was performed with the formation of oxy, deoxy, and CO complex. In addition, kinetics measurements of O2 affinity were performed using a Stoppedflow system and the dissociation rate constant value obtained was 0.0526 s -1 , whereas the association rate constant was 0.19 x 106 M -1 s -1 . These values were similar to the native HbII dissociation and association constants, 0.11 s -1 and 0.390 x 106 M -1 s -1 , respectively.

Lucina pectinata es un molusco bivalvo que habita en sedimentos ricos en sulfuro; en la costa oeste de Puerto Rico. Esta almeja contiene tres hemoglobinas, las cuales entregan y transportan oxígeno (hemoglobina II y III) y sulfuro de hidrógeno (hemoglobina I) a una bacteria quimioautótrofa. La hemoglobina II es una proteína reactiva a oxígeno en la cual este se halla enlazado al grupo hemo a través de puentes de hidrógeno con Tyr30 (B10) y Gln65 (E7). Esto resulta en que la velocidad de disociación de oxígeno sea extremadamente baja (0.11 s -1 ). Trabajos previos han demostrado que HbII es muy resistente a la oxidación de H2O2 y NO, características típicas para el desarrollo de derivados de transportadores de oxígeno. Sin embargo, es necesario mejorar el enlazamiento de oxígeno e inducir propiedades alostéricas de HbII. Esto es logrado a través de mutaciones dirigidas de HbII. Aquí nosotros reportamos la expresión de la hemoglobina II recombinante se obtuvo luego de una inducción en un tiempo de 3-4 horas y el rendimiento máximo de proteína obtenido fue 134.72 mg/L utilizando el vector de expresión pET28 transformado en las bacterias BLi5. Las condiciones óptimas de expresión ocurrieron cuando la inducción se llevo a cabo a 30 °C y el medio ―Terrific Broth‖ fue suplementado con 1 mM IPTG, 60 µg/mL cloruro de hemo y 1% glucosa. Para monitorear la expresión, se extrajeron las proteínas, y además se purificó rHbII con una resina de afinidad metálica para obtener rHbII. El producto fue analizado utilizando un espectrofotómetro de UVVis y la concentración de la proteína de rHbII fue determinada utilizando el coeficiente de extinción molar de 129 mM-1 cm-1 a 414 nm para rHbII en su forma oxy. La caracterización funcional de rHbII fue llevada a cabo con la formación de complejos con O2 y CO. Además, se realizaron medidas cinéticas para determinar la afinidad con O2 utilizando un sistema de ―Stopped Flow‖. El valor obtenido de la constante de disociación fue 0.0526 s-1 y 0.19 x 106 M -1 s -1 para la constante de asociación. Estos valores son muy similares a las constantes de disociación y asociación de HbII en su forma nativa, 0.11 s -1 y 0.390 x 106 M -1 s -1 , respectivamente.