Kinetic, intracellular ATP growth and maintenance studies, and modeling of metabolically engineered Zymomonas mobilis fermenting glucose and xylose mixtures

Abstract

Intracellular adenosine-5’-triphosphate (ATP) levels were measured in a metabolically engineered Zymomonas mobilis strain 8b over the course of batch fermentations of glucose and xylose mixtures. Recombinant Z. mobilis, a gram-negative bacterium that distinctively uses the Entner-Doudoroff pathway (net yield of only one mole ATP per mole of glucose or, putatively, xylose consumed), is capable of efficiently converting both glucose and xylose to ethanol as well as to moderately tolerate acetic acid and other inhibitory components typically present in biomass hydrolyzates. Fermentations were conducted over a range of pH (5–6) in the presence of varying initial amounts of acetic acid (0–8 g/L) using a 10% (w/v) total sugar concentration (glucose only, xylose only, or 5% glucose/5% xylose mixtures). Specifically, when xylose was one of the sugar substrates or the sole substrate, acetic acid and/or low pH strongly affected maximum specific intracellular ATP production rates (7.3–26.0 g ATP/g DCM-h), accumulation rates (0.1–1.0 mg ATP/g DCM-h), accumulation levels (1.5–3.8 mg ATP/g DCM), maximum specific cellular growth rates (0.10 ± 0.01–0.33 ± 0.03 h-1), and ethanol process yields (56.6–95.4 ± 1.6%). Specific ATP accumulation rates (mg ATP/g DCM-h) are several orders of magnitude lower than the rates of ATP production (g ATP/g DCM-h), indicating that ATP accumulation and dilution terms can be neglected to enable a simplified intracellular ATP balance wherein the specific rate of ATP production is balanced by the total rate of ATP consumption (i.e., for cell growth and maintenance). Findings suggest that reductions in ATP production and consumption rates under increased stress conditions are associated with the uncoupling phenomenon. A novel improved flocculating recombinant strain 8bF of Z. mobilis was developed and isolated. The superiority of Z. mobilis strain 8bF in enabling more rapid and efficient fermentation of glucose and xylose to ethanol was demonstrated in both batch and continuous cultures. Specifically, in uncontrolled pH shake-flask batch fermentations, the flocculent Z. mobilis strain 8bF exhibited better pH stability (kept pH ≥ 4), grew to a higher final cell mass concentration (≥ 2 g/L of DCM), and achieved higher glucose and xylose mixture conversions (3–4-fold higher sugar utilization percentages) and higher ethanol yields (2–3-fold higher metabolic yields) than the non-flocculating parental strain 8b. During the chemostat runs, 8bF was able to maintain high cell mass concentrations (~8 g/L of DCM at µ = 0.47 h-1), high glucose and xylose mixture conversions, high ethanol productivities (~3-fold higher than 8b), and high ethanol yields at dilution rates well above 0.15 h-1. Advantages of Z. mobilis 8bF in comparison to other ethanologenic bacteria include: (i) the ability to flocculate, (ii) better pH stability, (iii) the ability to ferment sugars at 4 ≤ pH ≤ 5, (iv) biomass concentrations above 7 g/L of DCM at 0.19 h-1 ≤ µ ≤ 0.47 h-1, (v) high sugar mixture conversions achieved, (vi) high specific and volumetric ethanol productivities, (vii) high ethanol process and metabolic yields, and (viii) potential of facilitated and lower costs during cell separation and ethanol recovery steps. An intracellular ATP balance-based method is described to quantify glucose and xyloseassociated growth and non-growth (maintenance) energy requirements. Zymomonas mobilis strain 8b continuous fermentations were conducted at different pH values (5.0, 5.3, 5.5, or 6.0) and initial acetic acid concentrations (0, 2, and 4 g/L) while maintaining a constant temperature (30°C), agitation rate (300 rpm), and the sugar mixture feed concentration (5% glucose/5% xylose) supplemented with or without acetic acid. ATP requirements for cell growth and maintenance were calculated, and a significant dependence upon pH was observed, with the concentration of acetic acid exerting the strongest effect on maintenance ATP requirements. Specifically, calculated ATP maintenance rates varied significantly across the experimental design space tested (3.29–12.94 g ATP/g DCM-h). The highest maintenance requirement, 12.94g ATP/g DCM-h, was obtained at pH 5.3 and 4 g/L of initial acetic acid (higher stress condition), and the lowest, 3.29 g ATP/g DCM-h, at pH 6 with 2 g/L of initial acetic acid (low stress condition). A response surface linear model accurately predicted these specific ATP maintenance requirements across the experimental design space studied. Cell mass yields on ATP (6.03 ± 1.51g DCM/mol ATP) did not vary significantly with stress levels. A mathematical model based on calculations of a maintenance-related rate (rATP,m-H+) was developed to predict the pH-dependent uncoupling effect of acetic acid in steady state Z. mobilis 8b continuous cultures. Calculations and model predictions demonstrated that the uncoupling of the plasma membrane potential in Z. mobilis 8b chemostat cultures increased the maintenancerelated ATP consumption and became more severe in the presence of high initial acetic acid concentrations. Specifically, the highest uncoupling effect was obtained when the initial acetic acid concentration was increased to 4 g/L and using pHext values of 5.3 or 6 (rATP,m-H+ = ~0.6–0.8mmol ATP/g DCM-h). The model predicts accurately that the larger the ∆pH established across the plasma membrane in Z. mobilis 8b continuous fermentations, the higher the values of rATP,mH+ (and hence, higher observed inhibitory effects) are required at different culture conditions. Model validation resulted more challenging, predictions of validation runs were modest at pHext values below or above 5.5. Overall, a substantially better understanding of recombinant Z. mobilis strains 8b and 8bF batch and continuous mixed sugar (glucose and xylose) ethanol fermentations was accomplished. Specifically, the ability to accurately characterize fermentation kinetics, determine intracellular ATP levels (accumulation dynamics), quantify ATP production and consumption rates, and mathematically model a maintenance-related rate (rATP,m-H+) to predict the pH-dependent uncoupling effect of acetic acid in Z. mobilis strain 8b cultivations was achieved. More research is needed to identify the actual magnitude of the specific ATP consumption rates for H+ export (rATP,m-H+, maintenance-related rate) under increased stress conditions and to further validate the mathematical model.

Niveles intracelulares de adenosina-5’-trifosfato (ATP) fueron medidos en la cepa recombinante 8b de Zymomonas mobilis a través de fermentaciones por tandas de mezclas de glucosa y xilosa. Zymomonas mobilis recombinante, una bacteria gram-negativa que usa distintivamente la ruta metabólica Entner-Doudoroff (rendimiento neto de solo un mol de ATP por mol de glucosa o xilosa teórica consumida), es capaz de convertir eficientemente tanto glucosa como xilosa a etanol como también tolerar moderadamente ácido acético u otros componentes inhibitorios que están típicamente presente en los hidrolizados de biomasa. Fermentaciones fueron llevadas a cabo usando un intervalo de pH (5–6) y en presencia de varias concentraciones iniciales de ácido acético (0–8 g/L) a una concentración total de azúcar de 10% (w/v) (glucosa sola, xilosa sola, o mezclas de 5% glucosa/5% xilosa). Específicamente, cuando xilosa fue uno de los sustratos azucarados o el único sustrato, ácido acético estuvo presente y/o se utilizó un pH bajo la tasas específicas máximas de producción de ATP intracelular (7.3–26.0 g ATP/g DCM-h), tasas de acumulación (0.1–1.0 mg ATP/g DCM-h), niveles de acumulación (1.5–3.8 mg ATP/g DCM), tasas específicas máximas de crecimiento celular (0.10 ± 0.01–0.33 ± 0.03 h-1), y rendimientos de proceso de etanol (56.6–95.4 ± 1.6%) fueron afectados considerablemente. Las tasas específicas de acumulación de ATP (mg ATP/g DCM-h) están varios órdenes de magnitud por debajo de las tasas de producción de ATP (g ATP/g DCM-h), indicando que los términos de acumulación y dilución de ATP pueden ser despreciados para obtener un balance intracelular de ATP simplificado en donde la tasa específica de producción de ATP está balanceado con la tasa total de consumo de ATP (i.e., para crecimiento o mantenimiento). Hallazgos sugieren que reducciones en las tasas de producción y consumo de ATP bajo condiciones de tensión altas están asociadas con el fenómeno de desacoplamiento. La cepa novel recombinante y floculante 8bF de Z. mobilis fue desarrollada y aislada. La superioridad de esta cepa 8bF de Z. mobilis para lograr fermentaciones mas rápidas y eficientes de glucosa y xilosa a etanol fue demostrada tanto en cultivos por tandas como en continuos. Específicamente, en fermentaciones por tandas sin controlar el pH y utilizando frascos, la cepa floculante 8bF de Z. mobilis exhibió un pH más estable (manteniendo el pH ≥ 4), creció hasta concentraciones de masa celular más altas (≥ 2 g/L de DCM), y logró conversiones más altas de las mezclas de glucosa y xilosa (porcentajes de utilización de azúcar fueron de 3–4-veces más altos) al igual que rendimientos mayores de etanol (rendimientos metabólicos de 2–3-veces más altos) que la cepa original no floculante 8b. En las corridas de quimiostatos, 8bF fue capaz de mantener concentraciones de masa celular altas (~8 g/L de DCM a µ = 0.47 h-1), altas conversiones de mezclas de glucosa y xilosa, altas productividades de etanol (~3-veces más alta que 8b), y altos rendimientos de etanol a tasas de dilución bien por encima de 0.15 h-1. Ventajas de Z. mobilis 8bF en comparación con otras bacterias productoras de etanol incluyen: (i) la habilidad de flocular, (ii) pH más estable, (iii) la habilidad de fermentar azúcares a 4 ≤ pH ≤ 5, (iv) generar concentraciones de biomasa sobre 7 g/L de DCM a 0.19 h-1 ≤ µ ≤ 0.47 h-1, (v) lograr conversiones altas de mezclas de azúcares, (vi) altas productividades volumétricas y específicas de etanol, (vii) altos rendimientos de proceso y metabólicos de etanol y (viii) el potencial de facilitar al igual que bajar los costos de separación celular y recuperación de etanol. Un método basado en el balance intracelular de ATP es descrito para cuantificar el crecimiento asociado a glucosa y xilosa y los requerimientos de energía no relacionados a crecimiento (mantenimiento). Fermentaciones continuas con Z. mobilis cepa 8b fueron llevadas a cabo a valores diferentes de pH (5.0, 5.3, 5.5, o 6.0) y concentraciones iniciales de ácido acético (0, 2, y 4 g/L) mientras se mantenía constante la temperatura (30°C), agitación (300 rpm), y la concentración de azúcares mezcladas (5% glucosa/5% xilosa) suplidas con o sin ácido acético en la alimentación. Los requerimientos de ATP tanto para crecimiento como para mantenimiento celular fueron calculados, y una dependencia significativa con respecto al pH fue observada, siendo la concentración de ácido acético la que ejerció el efecto más fuerte en los requerimientos de ATP para mantenimiento. Específicamente, las tasas de mantenimiento de ATP calculadas variaron significativamente a través del espacio de diseño experimental estudiado (3.29–12.94 g ATP/g DCM-h). El requerimiento para mantenimiento más alto, 12.94 g ATP/g DCM-h, fue obtenido a pH 5.3 y 4 g/L de ácido acético inicial (condición de tensión más alta), y el más bajo, 3.29 g ATP/g DCM-h, a pH 6 y 2 g/L de ácido acético inicial (condición de tensión baja). Un modelo lineal de superficie de respuesta predijo exactamente estos requerimientos de ATP específicos para mantenimiento a través del espacio de diseño experimental estudiado. Rendimientos de masa celular en ATP (6.03 ± 1.51 g DCM/mol ATP) no variaron significativamente con los niveles de tensión. Un modelo matemático basado en los cálculos de una tasa relacionada al mantenimiento (rATP,m-H+) fue desarrollado para predecir el efecto dependiente de pH de desacoplamiento por ácido acético en cultivos continuos de Z. mobilis 8b en estado estacionario. Cálculos y predicciones del modelo demostraron que el desacoplamiento del potencial en la membrana de plasma en quimiostatos de Z. mobilis 8b aumentó el consumo de ATP relacionado al mantenimiento, y éste resultó más severo en la presencia de altas concentraciones iniciales de ácido acético. Específicamente, el efecto mayor de desacoplamiento fue obtenido cuando la concentración inicial de ácido acético fue aumentada a 4 g/L y utilizando valores de pHext de 5.3 o 6 (rATP,m-H+ = ~0.6–0.8 mmol ATP/g DCM-h). Este modelo predice exactamente que a la manera que aumente el ∆pH establecido a través de la membrana plasma en fermentaciones continuas de Z. mobilis 8b, mayores valores de rATP,m-H+ (y por lo tanto, mayor el efecto inhibitorio observado) son requeridos en cultivos a diferentes condiciones de operación. La validación del modelo resultó ser más retadora. Predicciones de estas corridas de validación no fueron tan buenas a valores de pHext por debajo o por encima de 5.5. En general, un mayor entendimiento fue logrado sobre las fermentaciones por tandas y continuas de azúcares mezcladas (glucosa y xilosa) a etanol por las cepas 8b y 8bF de Z. mobilis. Específicamente, la habilidad de caracterizar la cinética de fermentación con exactitud, determinar los niveles de ATP intracelular (dinámica de acumulación), cuantificar la tasas de producción y consumo de ATP, y el modelar matemáticamente una tasa relacionada al mantenimiento (rATP,m-H+) para predecir el efecto dependiente de pH de desacoplamiento por ácido acético en cultivos de Z. mobilis cepa 8b fue logrado. Más investigación es necesaria para identificar la magnitud actual de estas tasas específicas de consumo de ATP para la exportación de H+ (rATP,m-H+, tasa relacionada al mantenimiento) a condiciones de tensión altas, y también para validar con mayor exactitud el modelo matemático desarrollado.