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Expression, purification and characterization of a human calcium-binding protein: Human centrin 2
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Abstract
Human centrin 2 (Hcen 2) is an acidic centrosomal protein of 19,738 Da, that is
comprised of four subdomains, called EF-hands, which represent the calcium-binding
sites. Human centrin 2 gene locus is codified on chromosomes X and had been
designated as Hcetn2. Hcen2 may play a role in centrosome duplication and segregation
during mitosis. Transformed bacterial E. coli cells with a recombinant molecule
containing the Hcetn2 gene were grown in either 2xYT broth or 13C isotope enriched
minimal media and induced to over-express the Hcen 2 and 13C-Hcen 2, respectively.
These recombinant proteins were then purified by using hydrophobic affinity
chromatography followed by several anion exchange chromatographic separations.
Highly pure Human centrin 2 and 13C-homogenously labeled protein were obtained for
biophysical studies. Differential scanning calorimetric (DSC) study of Hcen 2 showed
that this is a very stable protein with a pre-transition temperature around 85 °C and a
thermal transition temperature of 120 °C.
La centrina humana 2 (Hcen 2) es una proteĂna acĂdica del centrosoma con un peso molecular de 19, 738 Da. EstĂ¡ compuesta por cuatro sub-dominios llamados manos de EF, los cuales representan sitios de enlace para calcio. El gen de la centrina humana 2 estĂ¡ codificado en el cromosoma X y ha sido nombrado como Hcetn2. Hcen 2 parece desempeñar un papel importante en la duplicaciĂ³n y segregaciĂ³n del centrosoma durante la mitosis. CĂ©lulas bacterianas competentes E. coli fueron transformadas con el gen que codifica para Hcetn2 y crecidas en dos tipos de caldos de cultivo: 2xYT y en un medio mĂnimo enriquecido marcado con 13C. Luego se indujeron para sobre-expresar las proteĂnas Hcen 2 y 13C-Hcen 2. Dichas proteĂnas fueron purificadas usando cromatografĂa de afinidad hidrofĂ³bica, la cual fue seguida por varios pasos de separaciĂ³n mediante cromatografĂa de intercambio aniĂ³nico. La centrina humana 2 y su forma marcada con 13C fueron obtenidas con gran pureza para realizar estudios biofĂsicos. Los estudios de calorimetrĂa de rastreo diferencial de la centrina humana 2 muestran que esta es una proteĂna estable con una pre-transiciĂ³n a 85 °C y una temperatura de desnaturalizaciĂ³n de 120 °C.
La centrina humana 2 (Hcen 2) es una proteĂna acĂdica del centrosoma con un peso molecular de 19, 738 Da. EstĂ¡ compuesta por cuatro sub-dominios llamados manos de EF, los cuales representan sitios de enlace para calcio. El gen de la centrina humana 2 estĂ¡ codificado en el cromosoma X y ha sido nombrado como Hcetn2. Hcen 2 parece desempeñar un papel importante en la duplicaciĂ³n y segregaciĂ³n del centrosoma durante la mitosis. CĂ©lulas bacterianas competentes E. coli fueron transformadas con el gen que codifica para Hcetn2 y crecidas en dos tipos de caldos de cultivo: 2xYT y en un medio mĂnimo enriquecido marcado con 13C. Luego se indujeron para sobre-expresar las proteĂnas Hcen 2 y 13C-Hcen 2. Dichas proteĂnas fueron purificadas usando cromatografĂa de afinidad hidrofĂ³bica, la cual fue seguida por varios pasos de separaciĂ³n mediante cromatografĂa de intercambio aniĂ³nico. La centrina humana 2 y su forma marcada con 13C fueron obtenidas con gran pureza para realizar estudios biofĂsicos. Los estudios de calorimetrĂa de rastreo diferencial de la centrina humana 2 muestran que esta es una proteĂna estable con una pre-transiciĂ³n a 85 °C y una temperatura de desnaturalizaciĂ³n de 120 °C.
Description
Date
2005
Journal Title
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Collections
Keywords
Human centrin 2 (Hcen 2), EF-hands, Hcetn2, Bacterial E. coli cells, Hydrophobic affinity chromatography, C-homogenously labeled protein