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Determining the role of FAP1 in S. cerevisiae, cultivated in nitrogen-limited media
Criollo Fajardo, Melisa M.
Criollo Fajardo, Melisa M.
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Abstract
FAP1 is a cytoplasmic protein found in Saccharomyces cerevisiae. During Rapamycin treatment, FAP1 binds Fpr1p for conferring resistance to yeast cells. Rapamycin is lethal to yeast cells because it can also bind Fpr1p, and this complex interferes negatively with the TORC1 function, which is responsible for nutrient-regulated gene expression. Currently, FAP1 function remains poorly understood. It has been suggested that under nutrient-deficient conditions, the fap1 gene is over-expressed and becomes essential for yeast to survive. This work identified the expression levels of the fap1 gene when Saccharomyces cerevisiae is exposed in Nitrogen-limited media (NLM) to 0 h, 3 h, 6 h and 9 h. After harvesting yeast cells, total RNA was extracted and then treated with Reverse Transcriptase to create complementary DNA (cDNA), yielded cDNA with concentrations ranging from 1939 ng/µL (0 h), 1608 ng/µL (3 h), 1845 ng/µL (6 h) and 1521 ng/µL (9 h). Subsequently, qPCR experiments were performed using cDNA samples from yeast cells grown in YPD (control) at 0 h. This served to validate the amplification efficiency of the fap1 gene relative to the endogenous fba1 gene, establishing the necessary conditions for acquiring experimental cycle threshold (CT) values. fap1 cDNA exhibited an increased expression in each of the three experimental media studied here (NLM) as time progresses.
FAP1 es una proteína citoplasmática encontrada en Saccharomyces cerevisiae. Durante el tratamiento con rapamicina, FAP1 se une a Fpr1p para conferir resistencia a las células de levadura. La rapamicina es letal para las células de levadura porque también puede unirse a Fpr1p, y este complejo interfiere negativamente con la función de TORC1, que es responsable de la expresión génica regulada por nutrientes. Actualmente, las funciones de FAP1 siguen siendo poco comprendidas. Se sugiere que, bajo condiciones deficientes en nutrientes, el gen fap1 se sobreexpresa y se vuelve esencial para que la levadura sobreviva. Este trabajo identificó los niveles de expresión del gen fap1 cuando Saccharomyces cerevisiae estuvo expuesta a medios limitados de nitrógeno (MLN) durante 0 h, 3 h, 6 h y 9 h. Luego de recolectar las células de levadura, se extrajo el ARN total y éste fue tratado con la enzima transcriptasa inversa para crear muestras de ADN complementario (cADN), obteniéndose concentraciones que van desde 1939 ng/μL (0 h), 1608 ng/μL (3 h), 1845 ng/μL (6 h) y 1521 ng/μL (9 h). Posteriormente, se realizaron experimentos de qPCR utilizando muestras de cADN de células de levadura cultivadas en YPD (control) a 0 h. Esto sirvió para validar la eficiencia de amplificación del gen fap1 en relación con el gen endógeno fba1, estableciendo las condiciones necesarias para adquirir valores de ciclo umbral experimental (CT). fap1 mostró una mayor expresión en cada uno de los tres medios experimentales estudiados (MLN) a medida que avanza el tiempo.
FAP1 es una proteína citoplasmática encontrada en Saccharomyces cerevisiae. Durante el tratamiento con rapamicina, FAP1 se une a Fpr1p para conferir resistencia a las células de levadura. La rapamicina es letal para las células de levadura porque también puede unirse a Fpr1p, y este complejo interfiere negativamente con la función de TORC1, que es responsable de la expresión génica regulada por nutrientes. Actualmente, las funciones de FAP1 siguen siendo poco comprendidas. Se sugiere que, bajo condiciones deficientes en nutrientes, el gen fap1 se sobreexpresa y se vuelve esencial para que la levadura sobreviva. Este trabajo identificó los niveles de expresión del gen fap1 cuando Saccharomyces cerevisiae estuvo expuesta a medios limitados de nitrógeno (MLN) durante 0 h, 3 h, 6 h y 9 h. Luego de recolectar las células de levadura, se extrajo el ARN total y éste fue tratado con la enzima transcriptasa inversa para crear muestras de ADN complementario (cADN), obteniéndose concentraciones que van desde 1939 ng/μL (0 h), 1608 ng/μL (3 h), 1845 ng/μL (6 h) y 1521 ng/μL (9 h). Posteriormente, se realizaron experimentos de qPCR utilizando muestras de cADN de células de levadura cultivadas en YPD (control) a 0 h. Esto sirvió para validar la eficiencia de amplificación del gen fap1 en relación con el gen endógeno fba1, estableciendo las condiciones necesarias para adquirir valores de ciclo umbral experimental (CT). fap1 mostró una mayor expresión en cada uno de los tres medios experimentales estudiados (MLN) a medida que avanza el tiempo.
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Date
2024-07-09
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Keywords
gene expression, nitrogen limited media, FAP1, Saccharomyces cerevisiae, qPCR