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Detection of flavins exhibiting autofluorescence from "in vivo" bacterial samples using one photon and two photon confocal microscopy
Padilla Jiménez, Amira C.
Padilla Jiménez, Amira C.
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Abstract
Studies have shown that certain types of biological agents - bacteria, viruses and fungi - can be observed by their intrinsic fluorescence. These biomolecules include amino acids, coenzymes such as nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and flavins. Recently, it has been shown that confocal microscopy is a very good method for the detection and study of single particles in live organisms or tissues which incorporate natural fluorophores. The purpose of this research project is to develop an analytical methodology for the detection of flavin compounds bacteria aqueous suspension that exhibit intrinsic fluorescence prepared from biological culture media. It is also important to determine the different flavins cofactors present in various species of bacteria; we have focused our attention on three main derivatives of flavins. These include riboflavin (RF) and its two biologically active metabolites: flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide (FAD). One and two photon excited (TPE) fluorescence spectroscopy of intrinsic fluorophores from bacteria aqueous suspensions “in vivo” using confocal microscopy were performed to obtain the TPE spectra of eleven microorganisms: eight bacteria and three fungi. These obtained spectra are the results innovative in the visible region and excited in the near IR at 780nm for to reduce level of photodamage on cells. As expected the emission from all bacteria samples were originated in similar range of emission wavelengths. In addition, we report a reproducible analytical methodology for determining the intrinsic fluorescence spectra of different bacteria aqueous suspension samples by fluorescence correlation spectroscopy (FCS) using Matlab, SimFCS, SPSS, and Minitab programs, to obtain the fluctuations diagrams from confocal microscopy, and then for data manipulation to determine the autocorrelation graph, which contains the dynamic information of the analytes, and later, the fit of this data to a mathematical function. Furthermore, it was found by fluorescence information obtained from Raman spectroscopy instrument in its emission mode, and fluorimeter that the relative concentrations of flavin cofactors at high concentration of bacteria samples (20μL UFC), are present at an approximate concentration of riboflavin 250nM in B. subtilis, FAD 100nM in E. coli and FMN 50nM in B. cereus, but, at low concentration of bacteria samples (10μL UFC), concentration as low as 10.0nM of these flavin cofactors were observed.
Estudios han mostrado que, ciertos tipos de agentes biológicos – bacterias, virus y hongos - pueden ser observados por su fluorescencia intrínseca. Estas biomoléculas incluyen a aminoácidos, coenzimas tales como nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y flavinas. Recientemente, ha sido mostrado que microscopía confocal es un buen método para la detección y estudio de partículas individuales en los organismos vivos o en tejidos los cuales tienen incorporados fluoróforos naturales. El propósito de este proyecto de investigación es desarrollar una metodología analítica para la detección de compuestos de flavina en suspensión acuosa de bacterias que exhiben fluorescencia intrínseca, preparadas a partir de medios de cultivos biológicos. Es también importante determinar, los diferentes cofactores de flavinas presentes en varias especies de bacterias con la meta de determinar los diferentes cofactores de flavinas presentes en varias especies de bacterias; y hemos enfocado nuestra atención sobre tres principales derivados de flavinas. Estas incluyen riboflavina (RF) y sus dos metabolitos biológicamente activos: Flavin mononucleotido (FMN) y Flavin adenina dinucleótido (FAD). Espectroscopia de Fluorescencia de uno y dos fotones excitados (TPE, por sus siglas en ingles) de fluoróforos intrínsecos a partir de suspensión acuosa de bacterias “in vivo” usando microscopia confocal fue realizado, para obtener los espectros de TPE de once microorganismos: ocho bacterias y tres hongos. Estos espectros obtenidos son resultados innovadores en la región visible y excitada en el IR cercano a 780nm para reducir el nivel de fotodaños sobre las células. Mientras que la emisión de todas las muestras de bacterias fueron originadas en un rango similar de longitud de onda de emisión esperada. Además, nosotros reportamos una metodología analítica reproducible para determinar los espectros de fluorescencia intrínseca de diferentes muestras de bacterias en suspensión acuosa por espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) usando programas de Matlab, SimFCS, SPSS, y Minitab, para obtener los diagramas de fluctuaciones del microscopio confocal, y entonces por manipulación de los datos determinar la grafica de autocorrelación, la cual contiene la información dinámica de los analitos y luego fijar estos datos a una función matemática. También fue encontrado por la información de fluorescencia obtenida del instrumento de espectroscopia Raman en su modo de emisión y el fluorimetro, que la concentración relativa de los cofactores de flavina a concentraciones altas de muestras de bacterias (20μL UFC), están presentes a una concentración aproximada de riboflavina 250nM en B. subtilis, FAD 100nM en E. coli y FMN 50nM en B. cereus, pero, a concentraciones bajas de muestras de bacterias (10μL UFC), concentraciones tan bajas como 10.0nM de estas flavinas fueron observadas.
Estudios han mostrado que, ciertos tipos de agentes biológicos – bacterias, virus y hongos - pueden ser observados por su fluorescencia intrínseca. Estas biomoléculas incluyen a aminoácidos, coenzimas tales como nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y flavinas. Recientemente, ha sido mostrado que microscopía confocal es un buen método para la detección y estudio de partículas individuales en los organismos vivos o en tejidos los cuales tienen incorporados fluoróforos naturales. El propósito de este proyecto de investigación es desarrollar una metodología analítica para la detección de compuestos de flavina en suspensión acuosa de bacterias que exhiben fluorescencia intrínseca, preparadas a partir de medios de cultivos biológicos. Es también importante determinar, los diferentes cofactores de flavinas presentes en varias especies de bacterias con la meta de determinar los diferentes cofactores de flavinas presentes en varias especies de bacterias; y hemos enfocado nuestra atención sobre tres principales derivados de flavinas. Estas incluyen riboflavina (RF) y sus dos metabolitos biológicamente activos: Flavin mononucleotido (FMN) y Flavin adenina dinucleótido (FAD). Espectroscopia de Fluorescencia de uno y dos fotones excitados (TPE, por sus siglas en ingles) de fluoróforos intrínsecos a partir de suspensión acuosa de bacterias “in vivo” usando microscopia confocal fue realizado, para obtener los espectros de TPE de once microorganismos: ocho bacterias y tres hongos. Estos espectros obtenidos son resultados innovadores en la región visible y excitada en el IR cercano a 780nm para reducir el nivel de fotodaños sobre las células. Mientras que la emisión de todas las muestras de bacterias fueron originadas en un rango similar de longitud de onda de emisión esperada. Además, nosotros reportamos una metodología analítica reproducible para determinar los espectros de fluorescencia intrínseca de diferentes muestras de bacterias en suspensión acuosa por espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) usando programas de Matlab, SimFCS, SPSS, y Minitab, para obtener los diagramas de fluctuaciones del microscopio confocal, y entonces por manipulación de los datos determinar la grafica de autocorrelación, la cual contiene la información dinámica de los analitos y luego fijar estos datos a una función matemática. También fue encontrado por la información de fluorescencia obtenida del instrumento de espectroscopia Raman en su modo de emisión y el fluorimetro, que la concentración relativa de los cofactores de flavina a concentraciones altas de muestras de bacterias (20μL UFC), están presentes a una concentración aproximada de riboflavina 250nM en B. subtilis, FAD 100nM en E. coli y FMN 50nM en B. cereus, pero, a concentraciones bajas de muestras de bacterias (10μL UFC), concentraciones tan bajas como 10.0nM de estas flavinas fueron observadas.
Description
Date
2005