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Design of composite protein microcrystals for the sustained oral delivery of antigens
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Abstract
Oral immunization is a promising method to decrease access of allergens and pathogens to the body. Oral delivery of antigens is challenged by the anatomical conditions of the gastrointestinal tract, such as degradation by the acidic environment of the stomach and protein breakdown by proteases. The use of protein composite microcrystals to deliver antigens to the gastrointestinal tract was proposed to challenge these difficulties. Composite microcrystals were composed of an antigen in the form of crystalline protein and a biodegradable polymeric carrier, alginate. This work focused on testing the application of this mechanism with the model protein lysozyme, insulin and ovalbumin, as well as testing the protein release behavior in simulated gastrointestinal conditions of lysozyme microcrystals from the alginate matrix. It was hypothesized that by using a protein in crystalline form, the release in simulated gastrointestinal conditions of the protein in alginate beads would be controlled and sustained. Alginate beads and microbeads were created via ionic crosslinking with calcium. Successful crystallization of lysozyme was performed in these systems demonstrating that calcium-alginate served as an adequate matrix for lysozyme protein crystallization. Protein release behavior of solvated and crystallized protein from alginate beads when exposed to simulated gastric and intestinal fluid was compared. Composite microcrystals released the majority of its content in simulated intestinal fluid and a smaller quantity in simulated gastric fluid. Protein transport of the liquid protein from the alginate matrix was characterized by the power law as pseudo Fickian, while the composite system was found to be anomalous, where the release is characterized by a combination of polymer relaxation and diffusion. Release kinetics studies showed that crystalline protein was released slower and in a sustained way than its liquid counterpart, independently from the alginate content being used as indicated by a smaller diffusion coefficient. The proposed crystallization method was furthermore applied to insulin and ovalbumin. Insulin was found to crystallize in covalent crosslinked alginate beads. Ovalbumin, on the other hand, preferably crystallizes on the surface of calcium alginate beads. These results showed a potential new approach for the oral delivery of proteins.
La inmunización a través de la vÃa oral es una forma prometedora de reducir el acceso de agentes alérgicos y patógenos al cuerpo. La degradación de antÃgenos por el ambiente acido del estómago y el rompimiento de proteÃnas por las proteasas son barreras anatómicas del sistema gastrointestinal que limitan la absorción de estos al cuerpo. Por estas razones para que el cuerpo desarrolle una respuesta inmune es necesario proteger el antÃgeno y liberar mayores cantidades del mismo. Para combatir estas dificultades se propuso el uso de microcristales de proteÃna compuesta para la liberación de antÃgenos al sistema gastrointestinal. Los microcristales combinados estaban compuestos de un antÃgeno en forma de cristal de proteÃna, y alginato, un polÃmero biodegradable, que sirve de matriz para llevar los microcristales al lugar de acción, a la misma vez que protege el antÃgeno. La hipótesis esperada es que al usar la proteÃna en forma cristalizada, la liberación de la proteÃna en condiciones simuladas gastrointestinales seria controlada y sostenida. Este trabajo se enfocó en probar este mecanismo con las proteÃnas modelos lisozima, insulina y ovoalbúmina. A la misma vez es de nuestro interés probar el comportamiento de liberación de proteÃna de esta proteÃna cristalizada en condiciones que simulan el sistema grastrointestinal. Esferas y microesferas de alginato fueron creadas con calcio como agente entrecruzante. Se cristalizo exitosamente la proteÃna lisozima en estos sistemas. Los resultados demuestran que alginato entrecruzado por calcio sirvió como sistema adecuado para la cristalización de lisozima. Se hicieron pruebas de la liberación de la proteÃna cristalizada de esferas de alginato en lÃquido simulado gástrico e intestinal para probar cómo este sistema se comportarÃa para la liberación del antÃgeno por la vÃa oral. Esto se comparó con la liberación de la matriz de alginato de la proteÃna en forma lÃquida, que se observa con mayor frecuencia en la literatura. El alginato resultó ser un polÃmero adecuado para la liberación de antÃgeno al intestino, ya que libero la mayorÃa de su contenido en el fluido intestinal simulado. El transporte de proteÃnas lÃquidas de la matriz de alginato se caracterizó por la ley de potencia como Fick, mientras que la de proteÃna cristalizada se caracterizó como anómala. Al examinar la cinética de liberación temprana de la matriz de alginato, se determinó que la proteÃna cristalina se liberó de la matrix de alginato más lentamente y de forma sostenida que sus análogos de proteÃna lÃquida. Esto fue confirmado con el cálculo de los coeficientes de difusión para estos dos sistemas. El sistema de liberación de antÃgeno propuesto se aplicó a la insulina y la ovoalbúmina. En el caso de la insulina, la cristalización de proteÃnas en bolitas de alginato ocurrió en polÃmeros de alginato entrecruzados covalentemente. Se encontró que ovoalbúmina prefiere cristalizar en la superficie o cerca del borde de las esferas de alginato. Estos resultados demuestran una nueva forma de liberar proteÃnas oralmente.
La inmunización a través de la vÃa oral es una forma prometedora de reducir el acceso de agentes alérgicos y patógenos al cuerpo. La degradación de antÃgenos por el ambiente acido del estómago y el rompimiento de proteÃnas por las proteasas son barreras anatómicas del sistema gastrointestinal que limitan la absorción de estos al cuerpo. Por estas razones para que el cuerpo desarrolle una respuesta inmune es necesario proteger el antÃgeno y liberar mayores cantidades del mismo. Para combatir estas dificultades se propuso el uso de microcristales de proteÃna compuesta para la liberación de antÃgenos al sistema gastrointestinal. Los microcristales combinados estaban compuestos de un antÃgeno en forma de cristal de proteÃna, y alginato, un polÃmero biodegradable, que sirve de matriz para llevar los microcristales al lugar de acción, a la misma vez que protege el antÃgeno. La hipótesis esperada es que al usar la proteÃna en forma cristalizada, la liberación de la proteÃna en condiciones simuladas gastrointestinales seria controlada y sostenida. Este trabajo se enfocó en probar este mecanismo con las proteÃnas modelos lisozima, insulina y ovoalbúmina. A la misma vez es de nuestro interés probar el comportamiento de liberación de proteÃna de esta proteÃna cristalizada en condiciones que simulan el sistema grastrointestinal. Esferas y microesferas de alginato fueron creadas con calcio como agente entrecruzante. Se cristalizo exitosamente la proteÃna lisozima en estos sistemas. Los resultados demuestran que alginato entrecruzado por calcio sirvió como sistema adecuado para la cristalización de lisozima. Se hicieron pruebas de la liberación de la proteÃna cristalizada de esferas de alginato en lÃquido simulado gástrico e intestinal para probar cómo este sistema se comportarÃa para la liberación del antÃgeno por la vÃa oral. Esto se comparó con la liberación de la matriz de alginato de la proteÃna en forma lÃquida, que se observa con mayor frecuencia en la literatura. El alginato resultó ser un polÃmero adecuado para la liberación de antÃgeno al intestino, ya que libero la mayorÃa de su contenido en el fluido intestinal simulado. El transporte de proteÃnas lÃquidas de la matriz de alginato se caracterizó por la ley de potencia como Fick, mientras que la de proteÃna cristalizada se caracterizó como anómala. Al examinar la cinética de liberación temprana de la matriz de alginato, se determinó que la proteÃna cristalina se liberó de la matrix de alginato más lentamente y de forma sostenida que sus análogos de proteÃna lÃquida. Esto fue confirmado con el cálculo de los coeficientes de difusión para estos dos sistemas. El sistema de liberación de antÃgeno propuesto se aplicó a la insulina y la ovoalbúmina. En el caso de la insulina, la cristalización de proteÃnas en bolitas de alginato ocurrió en polÃmeros de alginato entrecruzados covalentemente. Se encontró que ovoalbúmina prefiere cristalizar en la superficie o cerca del borde de las esferas de alginato. Estos resultados demuestran una nueva forma de liberar proteÃnas oralmente.
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Date
2015
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Keywords
Oral delivery, Composite microcrystals