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High level expression and thermal characterization of human centrin
De Orbeta-Cruz, Jessica M.
De Orbeta-Cruz, Jessica M.
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Abstract
Human centrin 1 (Hcen 1) is an acidic calcium binding protein with a molecular
mass of ~ 20 kDa and has been localized in human as well as in mouse testis, at the base
of the flagellar apparatus in sperm cells. Its putative function is associated with the
fertilized zygote duplication and motility of the sperm. In an effort to provide a better
understanding of the Hcen 1 structure, high level expression and protein purification,
using affinity and anion exchange chromatography, were performed. A successful
expression was obtained with optical density measures of 9 and an average of 40 grams
of bacterial pellet, what leads to 10 mg of ~ 99% pure Hcen 1. Differential Scanning
Calorimetry studies were done using the purified Hcen 1, obtaining two pre-transitional
peaks at ~ 58.42 ûC and ~ 88.82 ûC. These results suggest that Hcen 1 undergoes
conformational changes related with its N and C- terminal calcium binding capacities.
La isoforma humana centrin 1 (Hcen 1) es una proteÃna acÃdica con capacidad para enlazar moléculas de calcio. Esta proteÃna tiene un peso molecular de ~ 20 kDa y ha sido localizada en el cuerpo basal del flagelo del espermatozoide. Se ha propuesto que su función esta asociada a la primera división mitótica del cigoto y al motilidad del espermatozoide. En un esfuerzo por proveer un mejor entendimiento sobre la estructura de Hcen 1 se realizaron experimentos de expresión a gran escala seguidos de dos pasos de purificación utilizando cromatografÃa de afinidad e intercambio iónico. Se obtuvo una densidad óptica máxima de 9 y un promedio de 40 gramos de células de bacteria, finalmente se obtuvieron 10 mg de Hcen 1 con una pureza de ~ 99%. Estudios empleando la técnica de CalorimetrÃa Diferencial de Barrido fueron realizados utilizando muestra de la proteÃna purificada, dos pre transiciones fueron observadas en Hcen 1 a ~ 58.42 ûC y ~ 88.82 ûC, esto resultados sugieren cambios conformacionales en la proteÃna que podrÃan ser explicados por la diferencia existente en la capacidad de enlace de moléculas de calcio entre el terminal amino y carboxilo.
La isoforma humana centrin 1 (Hcen 1) es una proteÃna acÃdica con capacidad para enlazar moléculas de calcio. Esta proteÃna tiene un peso molecular de ~ 20 kDa y ha sido localizada en el cuerpo basal del flagelo del espermatozoide. Se ha propuesto que su función esta asociada a la primera división mitótica del cigoto y al motilidad del espermatozoide. En un esfuerzo por proveer un mejor entendimiento sobre la estructura de Hcen 1 se realizaron experimentos de expresión a gran escala seguidos de dos pasos de purificación utilizando cromatografÃa de afinidad e intercambio iónico. Se obtuvo una densidad óptica máxima de 9 y un promedio de 40 gramos de células de bacteria, finalmente se obtuvieron 10 mg de Hcen 1 con una pureza de ~ 99%. Estudios empleando la técnica de CalorimetrÃa Diferencial de Barrido fueron realizados utilizando muestra de la proteÃna purificada, dos pre transiciones fueron observadas en Hcen 1 a ~ 58.42 ûC y ~ 88.82 ûC, esto resultados sugieren cambios conformacionales en la proteÃna que podrÃan ser explicados por la diferencia existente en la capacidad de enlace de moléculas de calcio entre el terminal amino y carboxilo.
Description
Date
2006
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Keywords
Human centrin 1 (Hcen 1), Acidic calcium binding protein