Surface enhanced Raman spectroscopy of vegetative cells and endospores of Bacillus thuringiensis as a model for detection of biothreats

Abstract

The development of rapid and efficient techniques for biological detection, identification and classification has a positive impact in fields ranging medical, environmental and industrial microbiology to biological warfare agents countermeasures and national security. Traditional and standoff Raman spectroscopy can be used at near or long distances from the sample to obtain information of the chemical fingerprint of microorganisms. In this research, biochemical components of the bacterial cell wall and endospores of Bacillus thuringiensis (Bt) in aqueous suspensions and as well as aerosols particles were identified by surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) using small silver (Ag) nanospheres (NS) excited by a 532 nm as laser source. These nanoparticles were chemically reduced by hydroxylamine and borohydride and capped with citrate. Volume ratio of bacteria to NS, activation of “hot spots”, aggregation, and surface charge modification of the NS were studied and optimized to obtain good Bt signal enhancements by a simple SERS protocol of detection. A volume ratio of 0.125 using a bacterial concentration at the specific OD600 of 1 ± 0.1 and NaCl 0.1 M as blank was used to analyze the vegetative cells and endospores samples. Slight aggregation of the NS using NaCl 0.1M as well as surface charge modification to a more acidic ambient (pH range 5 to 7) was induced using small size (19±3 nm) borohydride reduced NS in the form of metallic suspensions aimed at increasing the Ag NS-Bt interactions. Principal component analyses (PCA) and partial least squares (PLS) regressions of SERS spectra coupled to discriminant analysis were used to classify and discriminate between vegetative cells and endospores components of bacterial samples growth at 5 and 24 h at a 95% confidence level and at different stages of bacterial growth. Bioaerosol detection was the largest challenge in this research. Results show that the optimization was successfully used observing and assigning the characteristic peaks of aerosolized Bt. In this study, the bacterial detection range used was 104 cells. In terms of concentration, it is important because is considered as pathogenic.

El desarrollo de técnicas rápidas y eficientes para la detección, identificación y caracterización de muestras biológicas tiene un impacto positivo desde varios campos de la medicina, medio ambiente y la microbiología industrial hasta campos como contramedidas de agentes de guerra biológica y la seguridad nacional. Espectroscopía Raman tradicional y a distancia puede ser utilizado a cortas o largas distancias de la muestra para obtener información de la huella química de los microorganismos. En esta investigación, los componentes bioquímicos de la pared celular y endosporas de Bacillus thuringiensis (Bt) en suspensiones acuosas y en forma de aerosoles fueron identificados por Espectroscopía Raman con aumento de señal por superficie (SERS) utilizando nanoesferas (NS) de plata (Ag) utilizando 532 nm de longitud de onda del láser de excitación. Estas nanopartículas fueron reducidas por hidroxilamina y por borohidruro estabilizadas con citrato. La relación de volumen de las bacterias a NS, la activación de "puntos calientes", la agregación, y la modificación de la carga superficial de las NS fueron los parámetros estudiados y optimizados para obtener buenos aumentos en las señales de Bt mediante un protocolo simple de detección de SERS. Una relación volumen de 0.125 con una concentración de bacterias a una medida de OD600 de 1 ± 0.1 con NaCl 0.1 M como blanco fue utilizado para las muestras de células vegetativas y endosporas. Agregación ligera de las NS utilizando NaCl 0.1 M, así como la modificación de la carga superficial a un ambiente más ácido (intervalo de pH 5 a 7) inducido a las pequeñas NS (19 ± 3 nm) reducidas con borohidruro en forma de suspensiones metálicas fue utilizado con el propósito de aumentar las interacciones Ag- NS-Bt. Un análisis de componentes principales (PCA) y de regresión de cuadrados mínimos parciales (PLS) de los espectros SERS, junto con análisis discriminante fueron utilizados para clasificar y discriminar entre componentes de las células vegetativas y endosporas en las muestras de 5 y 24 horas de crecimiento bacterial a un nivel de confianza de 95%, incluso pudo diferenciarse a diferentes etapas de crecimiento de Bt. La detección de los bioaerosoles fue el mayor reto en esta investigación. Los resultados mostraron que la optimización se utilizó con éxito para observar y asignar los picos característicos de aerosol de Bt. En este estudio, el rango de detección bacterial usado fue de 104 células, esta concentración es importante porque es considerado como patógeno.