Effect of the E11 amino acid on the ligand binding in Hemoglobin I from Lucina pectinata

Abstract

Hemoglobin I (HbI) from Lucina pectinata (clam) is a protein that binds and transports H2S to the bacteria in the clam. HbI is one of the few known hemoglobins that carries H2S, toxic gas, in its active site, which contains a GlnE7, PheB10, PheCD1 and PheE11. The stabilization of bound ligands, including H2S, appears to be dictated by the flexibility of the unusual distal heme pocket environment. Therefore, to define the role of the PheE11 on heme-ligand stability, FT-IR and kinetics studies were performed on HbI PheE11Val, PheE11Gln and PheE11Tyr using CO as ligand. The HbI PheE11Gln exhibited three stretching vibrational frequencies in the FT-IR spectrum: 1960 cm-1 (22%), 1948 cm-1 (15%), and 1939 cm-1 (64%). While, the HbI PheE11Tyr displayed vibrations located at 1962 cm-1 (34%), 1954 cm-1 (3%), and 1941 cm-1 (63%). The HbI PheE11Val showed just two vibrational peaks at 1955 cm-1 (24%) and 1942 cm-1 (76%). Each of these frequencies was assigned to different structural conformations. The higher frequencies are assigned as open conformations were no interactions occur. Whereas, lower frequencies were assigned to a closed conformation where the residues at the distal site (B10, E7, and E11) are having direct electrostatic interactions and/or hydrogen bond with the ligand. The results suggest that single site directed mutagenesis of the HbI heme pocket affect synergistically the displacement and orientation of other amino acids in the heme moiety. Also, we suggest that the PheE11 modulate the stabilization of the ligand by steric and hydrophobic interactions between the other nearby residues (GlnE7 and PheB10), and controls ligand migration in HbI.

La almeja Lucina pectinata contiene varias hemoglobinas entre las cuales se encuentra, Hemoglobina I (HbI), HbI es una proteína monomérica que enlaza y transporta ácido sulfhídrico (H2S). Esta es una de las pocas hemoglobinas que transportan este gas tóxico en su sitio activo. Los residuos en la región distal del grupo hemo: GlnE7, PheB10, PheCD1 y PheE11, parecen ser los responsables de la estabilización del ligando. Se ha demostrado que la matriz proteica muestra cierto grado de flexibilidad lo que permite la estabilización del ligando. Muchos estudios se han realizado para determinar la importancia y función de los aminos ácidos en la posición B10 y E7, pero poco se sabe sobre la posición E11. Para definir el papel que desempeña este amino ácido, se llevaron a cabo estudios de infrarrojo y cinéticos utilizando mutantes de HbI, donde la PheE11 fue sustituida por Val, Gln y Tyr. El espectro de IR para HbI PheE11Gln mostró tres bandas vibracionales a: 1960 cm-1 (22%), 1948 cm-1 (15%) y 1939 cm-1 (64%). Mientras que en el mutante HbI PheE11Tyr se observaron vibraciones localizadas en 1962 cm-1 (34%), 1954 cm-1 (3%) y 1941 cm-1 (63%). Sin embargo, el mutante HbI PheE11Val solo presentó dos bandas vibracionales a 1942 cm-1 (76%) y 1955 cm-1 (24%). A cada una de las frecuencias observadas se le ha asignado una conformación diferente del centro activo. Frecuencias altas fueron asignadas a una conformación abierta, donde no hay interacción con el ligando. Mientras que frecuencias bajas fueron atribuidas a una conformación cerrada, donde los residuos en la posición E7 y B10 están teniendo interacciones electrostáticas y/o puentes de hidrógeno con el ligando. Estos resultados sugieren que las mutaciones en el centro activo de HbI afecta sinergéticamente el desplazamiento y orientación de los amino ácidos cercanos al centro activo, que la PheE11 modula la estabilización del ligando mediante interacciones estéricas e hidrofóbicas entre los amino ácidos cercanos al hemo (GlnE7 y PheB10) y controla la migración del ligando.