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Detection and characterization of ππ’π€πͺπππΆπ΄ π’π―π΅π©π³π’π€πͺπ΄ lethal factor interacting proteins using human stomach T7 Phage Display cDNA libraries
Cardona-Correa, Albin A.
Cardona-Correa, Albin A.
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Abstract
The 2001 bioterrorism attacks to the USA using envelopes containing π. π’π―π΅π©π³π’π€πͺπ΄ spores increased the concern of scientists to fully understand the mode of action of the anthrax disease. π. π’π―π΅π©π³π’π€πͺπ΄ produces an exotoxin composed of three proteins. The first protein is the protective antigen (PA), which interacts with the human cell receptor TEM8 & CMG2 to allow the entrance of the two other subunits, edema factor (EF) and lethal factor (LF), to the cell by endocytosis. The EF interacts with the ATP molecules, causing an excess of cAMP which results in edema. On the other hand, the LF was found to cleavage most mitogen activated protein kinase (MAPK) kinases (MKKs) and then the NOD-like receptor proteins (NLRPs), resulting in cells apoptosis. If additional substrates suffer a LF-mediated cleavage, resulting in cell apoptosis, then we suggest novel LF-interacting partners to promote this biological process in gastrointestinal (GI) anthrax. T7 Phage Display (T7PD) is an πͺπ― π·πͺπ΅π³π° technique of combinatorial chemistry that allows the quick selection, amplification, and identification of potential ligands of specific biomolecules. The technique consists on the expression of cloned DNA sequences as fusion proteins on the T7 phage surface, allowing the study of protein-protein interactions. In this work, the technique was used to identify a profile of proteins that interact with LF, as additional substrates, in order to understand GI anthrax πͺπ― π·πͺπ΅π³π°. Four T7PD screenings, consisting of three biopanning rounds each one, were performed using a human stomach cDNA library in order to identify proteins that binds LF. A lethal factor wild-type (LF-WT) with metalloprotease activity and a mutant type (LF-MT) without protease activity were used as target to identify different sites for interaction. The T7PD LF- interacting partners were tittered; eventually, 192 were isolated for extract their DNA for a PCR reaction using specific primers to the cloning site. The DNA fragment sizes varied from 300- 900bp. After sequencing 124 clones a total of 33 proteins were identified πͺπ― π΄πͺππͺπ€π°, being mostly from protein families such as peptidase A1, lipase, and kruppel C2H2-type zinc-finger protein motifs. From these proteins, 18 were selected for a specificity test consisting of allowing the interaction of individual candidates with each type of LF and the blocking agent (5% casein). A total of 10 T7PD candidates were found to bind at least one type of LF tested. The candidate peptides belong to proteins from families such as peptidase A1, cytochrome, and Cation transport ATPase. The PAP46, a candidate from the peptidase A1 family, was found to interact with both types of LF tested with a target minimal concentration for interaction (MCI) of 1ΞΌg/mL. These findings could represent the identification of additional substrates for LF, besides the MKKs and NLRPs. In short, these putative novel peptides that bind LF πͺπ― π·πͺπ΅π³π° can be used to better understand anthrax disease at the molecular level, through the characterization of these substrates, and to develop new therapeutic agents.
Los ataques de bioterrorismo en el 2001 a los EE.UU. utilizando sobres con esporas de π. π’π―π΅π©π³π’π€πͺπ΄ aumentaron la preocupaciΓ³n de los cientΓficos en comprender plenamente el modo de acciΓ³n de la enfermedad del Γ‘ntrax. π. π’π―π΅π©π³π’π€πͺπ΄ produce una exotoxina compuesta de tres proteΓnas. La primera proteΓna es el antΓgeno protector (PA), que interactΓΊa con los receptores de la cΓ©lula humana TEM8 y CMG2 para permitir la entrada de las otras dos subunidades, factor edΓ©mico (EF) y factor letal (LF), a la cΓ©lula por endocitosis. El EF interactΓΊa con las molΓ©culas de ATP, causando un exceso de cAMP resultando en edema. Por otro lado, el LF fue encontrado de llevar a cabo escisiΓ³n en la mayorΓa de la proteΓnas quinasas activadas por mitΓ³genos (MKKs) y luego en las proteΓnas receptoras-NOD (NLRPs), resultando en apoptosis de las cΓ©lulas. Si sustratos adicionales sufren una escisiΓ³n mediada por LF, resultando en apoptosis celular, entonces sugerimos nuevos socios interactuantes de LF para promover este proceso biolΓ³gico en Γ‘ntrax gastrointestinal (GI). T7 ππ©π’π¨π¦ ππͺπ΄π±ππ’πΊ (T7PD) es una tΓ©cnica πͺπ― π·πͺπ΅π³π°, de la quΓmica combinatoria, que permite la rΓ‘pida selecciΓ³n, amplificaciΓ³n e identificaciΓ³n de ligandos potenciales para una biomolΓ©cula especΓfica. La tΓ©cnica consiste en la expresiΓ³n de secuencias de ADN clonados como proteΓnas de fusiΓ³n en la superficie de los fagos T7, permitiendo el estudio de interacciones proteΓna-proteΓna. En este trabajo, la tΓ©cnica fue utilizada para identificar un perfil de proteΓnas que interactΓΊan con LF, como sustratos adicionales, con el fin de entender el Γ‘ntrax GI πͺπ― π·πͺπ΅π³π° Cuatro monitoreos de T7PD, consistiendo cada uno en tres rondas de bioselecciΓ³n, se realizaron utilizando una biblioteca de ADNc de estΓ³mago humano con el fin de identificar aquellas proteΓnas que se unen a LF. Un LF tipo silvestre (LF-WT) con actividad de metaloproteasa y uno tipo mutante (LF-MT) sin actividad de proteasa, fueron utilizados para diferenciar sitios de interacciΓ³n. Los interactuantes de LF se cuantificaron; eventualmente, 192 fueron aislados para extraer su AND para una reacciΓ³n de PCR utilizando iniciadores especΓficos para el sitio de clonaciΓ³n. Los fragmentos de ADN variaron de 300-900pb. DespuΓ©s de la secuenciaciΓ³n de 124 clones se identificaron un total de 33 proteΓnas πͺπ― π΄πͺππͺπ€π°, siendo en su mayorΓa de las familias de proteΓnas tales como peptidasa A1, lipasa, y dedos de zinc tipo C2H2 Kruppel. De estas proteΓnas, 18 fueron seleccionadas para la prueba de especificidad que consistΓa en permitir la interacciΓ³n de candidatos individuales con cada tipo de LF y con el agente bloqueador (caseΓna al 5%). Un total de diez candidatos de T7PD fueron capaces de enlazar al menos un tipo de LF. Estos pΓ©ptidos pertenecen a proteΓnas de las familias peptidasa A1, citocromo y ATPasas de transporte de cationes. La PAP46, un candidato de la familia peptidasa A1, fue encontrado como un enlazador de ambos tipos de LF ensayados con una concentraciΓ³n mΓnima de interacciΓ³n para el objetivo (LF) de 1ΞΌg/mL. Estos hallazgos podrΓan representar la identificaciΓ³n de nuevos sustratos, ademΓ‘s de las MKKs y los NLRPs para LF. En resumen, estos posibles pΓ©ptidos noveles que enlazan al LF πͺπ― π·πͺπ΅π³π° pueden ser utilizados para entender mejor el Γ‘ntrax a nivel molecular, a travΓ©s de la caracterizaciΓ³n de estos sustratos, ademΓ‘s, para desarrollar nuevos agentes terapΓ©uticos.
Los ataques de bioterrorismo en el 2001 a los EE.UU. utilizando sobres con esporas de π. π’π―π΅π©π³π’π€πͺπ΄ aumentaron la preocupaciΓ³n de los cientΓficos en comprender plenamente el modo de acciΓ³n de la enfermedad del Γ‘ntrax. π. π’π―π΅π©π³π’π€πͺπ΄ produce una exotoxina compuesta de tres proteΓnas. La primera proteΓna es el antΓgeno protector (PA), que interactΓΊa con los receptores de la cΓ©lula humana TEM8 y CMG2 para permitir la entrada de las otras dos subunidades, factor edΓ©mico (EF) y factor letal (LF), a la cΓ©lula por endocitosis. El EF interactΓΊa con las molΓ©culas de ATP, causando un exceso de cAMP resultando en edema. Por otro lado, el LF fue encontrado de llevar a cabo escisiΓ³n en la mayorΓa de la proteΓnas quinasas activadas por mitΓ³genos (MKKs) y luego en las proteΓnas receptoras-NOD (NLRPs), resultando en apoptosis de las cΓ©lulas. Si sustratos adicionales sufren una escisiΓ³n mediada por LF, resultando en apoptosis celular, entonces sugerimos nuevos socios interactuantes de LF para promover este proceso biolΓ³gico en Γ‘ntrax gastrointestinal (GI). T7 ππ©π’π¨π¦ ππͺπ΄π±ππ’πΊ (T7PD) es una tΓ©cnica πͺπ― π·πͺπ΅π³π°, de la quΓmica combinatoria, que permite la rΓ‘pida selecciΓ³n, amplificaciΓ³n e identificaciΓ³n de ligandos potenciales para una biomolΓ©cula especΓfica. La tΓ©cnica consiste en la expresiΓ³n de secuencias de ADN clonados como proteΓnas de fusiΓ³n en la superficie de los fagos T7, permitiendo el estudio de interacciones proteΓna-proteΓna. En este trabajo, la tΓ©cnica fue utilizada para identificar un perfil de proteΓnas que interactΓΊan con LF, como sustratos adicionales, con el fin de entender el Γ‘ntrax GI πͺπ― π·πͺπ΅π³π° Cuatro monitoreos de T7PD, consistiendo cada uno en tres rondas de bioselecciΓ³n, se realizaron utilizando una biblioteca de ADNc de estΓ³mago humano con el fin de identificar aquellas proteΓnas que se unen a LF. Un LF tipo silvestre (LF-WT) con actividad de metaloproteasa y uno tipo mutante (LF-MT) sin actividad de proteasa, fueron utilizados para diferenciar sitios de interacciΓ³n. Los interactuantes de LF se cuantificaron; eventualmente, 192 fueron aislados para extraer su AND para una reacciΓ³n de PCR utilizando iniciadores especΓficos para el sitio de clonaciΓ³n. Los fragmentos de ADN variaron de 300-900pb. DespuΓ©s de la secuenciaciΓ³n de 124 clones se identificaron un total de 33 proteΓnas πͺπ― π΄πͺππͺπ€π°, siendo en su mayorΓa de las familias de proteΓnas tales como peptidasa A1, lipasa, y dedos de zinc tipo C2H2 Kruppel. De estas proteΓnas, 18 fueron seleccionadas para la prueba de especificidad que consistΓa en permitir la interacciΓ³n de candidatos individuales con cada tipo de LF y con el agente bloqueador (caseΓna al 5%). Un total de diez candidatos de T7PD fueron capaces de enlazar al menos un tipo de LF. Estos pΓ©ptidos pertenecen a proteΓnas de las familias peptidasa A1, citocromo y ATPasas de transporte de cationes. La PAP46, un candidato de la familia peptidasa A1, fue encontrado como un enlazador de ambos tipos de LF ensayados con una concentraciΓ³n mΓnima de interacciΓ³n para el objetivo (LF) de 1ΞΌg/mL. Estos hallazgos podrΓan representar la identificaciΓ³n de nuevos sustratos, ademΓ‘s de las MKKs y los NLRPs para LF. En resumen, estos posibles pΓ©ptidos noveles que enlazan al LF πͺπ― π·πͺπ΅π³π° pueden ser utilizados para entender mejor el Γ‘ntrax a nivel molecular, a travΓ©s de la caracterizaciΓ³n de estos sustratos, ademΓ‘s, para desarrollar nuevos agentes terapΓ©uticos.
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Date
2015