Expression of focal adhesions in response to inducing cellular orientation through mechanical transduction

Abstract

Loading frequency and the stiffness of the substrate are associated with changes in the expression of focal adhesions in adherent cells. In turn, any change in the characteristics of the focal adhesions generates a corresponding change in the orientation, morphology, motility and mechanical properties of the cell. This research aims to understand the manner in which substrate stiffness in combination with mechanically transduced stimuli influences the cell’s expression of its focal adhesions and orientation. To accomplish this a small cyclical tensile force was transmitted to mouse pre-osteoblast MC3T3-E1 cells through PDMS substrates of different stiffness. Cells were seeded on the substrates and incubated for 12 hours under static (no load) conditions, followed by 4 days of cyclic tensile loading for 5 minutes intervals interspersed with a 5 minute no-load phase. After the mechanical stimulus was applied, immunofluorescence labeling was performed on the cells to identify vinculin at the focal adhesion points, the actin stress fibers and nucleus. In conjunction with image processing through ImageJ®, the images were carefully analyzed to quantify the changes in cell behavior. The substrate’s modulus of elasticity, “E”, and surface roughness were measured and taken into account during analysis of the results. Proliferation, number of focal adhesion points, area of each focal adhesion and amount of inactive vinculin on each sample was influenced by the substrate’s stiffness and loading condition (cyclic/static). Proliferation and amount of inactive vinculin was higher on substrates subjected to cyclic stimulation when compared with the results of the static case, whereas the number and area of focal adhesion points underwent a reduction. The images obtained through confocal microscopy, did not reveal any significant orientation of the cells with respect to the applied strain axis as a result of the applied cyclic load. Thus a small strain of 1% at 0.05 Hz is probably not enough to align the cells either parallel or perpendicular to the principal strain axis. Nevertheless a significant difference was observed in cell distribution after analyzing the axis parallel and perpendicular to the direction of strain up to ±45°. Cells grown on the stiffer materials had a higher percentage of cells aligned parallel to the direction of strain when compared to those grown on the less rigid PDMS substrates. This remains true on the statically held substrates but to a lesser degree. Cells showed an increase in elongation with respect the substrate’s stiffness. Hence the cyclic stimulus to MC3T3-E1 cells appears to be important since it plays a role in the proliferation rate, characteristics of focal adhesions, vinculin expression, cell orientation and elongation.

La frecuencia de carga mecánica y la rigidez del substrato están relacionadas a cambios en la expresión de las adhesiones focales en células adherentes. A su vez, su dependencia genera un cambio en la orientación, morfología, motilidad y propiedades mecánicas de la célula. Esta investigación busca indagar como la rigidez del substrato junto con una estimulación mecánica afecta la expresión de las adhesiones focales y la orientación celular. Por ello una carga cíclica en tensión fue transmitida a través de substratos de distintas rigidez (PDMS a razones de 5:1, 10:1, 15:1 y 20:1) a la línea celular pre-osteoblastica MC3T3-E1. Las células fueron sembradas en los substratos y dejadas por 12 horas bajo condiciones estáticas (sin carga). Esto fue seguido por 4 días de una carga cíclica aplicada en tensión por intervalos de 5 minutos entremezclado con una fase de 5 minutos sin carga. Luego de la aplicación del estímulo mecánico, se prepararon las células para imunofluorescencía con el propósito de identificar la vinculina en los puntos de las adhesiones focales, las fibras de actina y el núcleo celular. En conjunto con el procesamiento de dichas imágenes a través de ImageJ®, los cambios en el comportamiento fueron analizados adecuadamente. El módulo de elasticidad del substrato, “E”, y la rugosidad de la superficie fueron medidas e integradas en el análisis de los resultados. La proliferación, el número de puntos de adhesiones focales, el área de cada adhesión focal y la cantidad de vinculina inactiva de cada muestra fue influenciada por la rigidez del substrato y la condición de carga (cíclica/estática). Proliferación y la cantidad de vinculina inactiva observada en los substratos sometido a estimulación cíclico fue mayor en comparación a los substratos estáticos. El número y área de los puntos focales sufrieron una disminución a consecuencia de la estimulación. Las imágenes obtenidas a través de microscopia confocal, no demuestran una preferencia significativa con respecto a un ángulo de orientación en particular como resultado de la carga cíclica aplicada, que parece indicar que una deformación pequeña de 1% a 0.05 Hz no es suficiente para alinear homogéneamente las células de modo paralelo o perpendicular al eje de deformación. Sin embargo una diferencia significativa fue observada en la distribución celular luego de analizar el eje paralelo y perpendicular a la dirección de la deformación hasta alcanzar ±45°. Las células cultivadas en los materiales más rígidos tuvieron un porcentaje mayor de células alineadas paralelas a la dirección de la deformación que aquellas crecidas en las razones de PDMS con menor rigidez. El patrón se mantiene en la cámara estática a una magnitud menor, la cual no tiene una carga inducida intencionalmente. La deformación presente en la cámara estática corresponde a la tensión mínima requerida para que los substratos se mantengan recto dentro de la cámara, pero la misma fue suficiente para inducir un leve alineamiento. Las células mostraron un incremento en elongación con respecto a la rigidez. Se comprobó que el estímulo mecánico cíclico es importante para las células MC3T3-E1 debido al papel que juega en la razón de proliferación, en el comportamiento de las adhesiones focales, la expresión de vinculina, orientación y elongación.