Unraveling the microbiome of the snail Caracolus marginella using metagenomics

Abstract

The increased of Antibiotic Resistance (AR) is currently one of the most important public health threats faced worldwide. Increasing rates on AR has been observed globally. The use and analysis of non-traditional techniques are required to solve this problem. Based on the fact that culture independent techniques as metagenomics can access the 100% of the genomes present in the environment. Metagenomics, as a culture independent approach, has become a powerful technique used in the analysis of microbiomes to facilitate the discovery of novel activities, including AR in diverse environments. Recent studies underestimate the microbial diversity and genotypic traits in the snails’ microbiome. Caracolus marginella, a land snail native to Caribbean islands, has the ability to adapt to different environments where biomedical potential has not been explored. Thity (30) specimens of C. marginella were collected from five collection sites in the four regions of the island. Our research focused the cultivable and uncultivable studies of C. marginella microbiome. To reach these goals, thirty-four isolates (bacteria and yeast) were identified from the snail gut. These were microbiologically characterized (macro and microscopically), and biotechnological applications for cellulose and starch were searched. Of these isolates, 61.7% and 8.8% of the organisms were positive for cellulose and starch degradation, respectively. Also, four metagenomic libraries from C. marginella gut microbiomes, from four different regions of Puerto Rico were generated and the AR activity assessed. High molecular weight (40kb) metagenomic libraries were generated from C. marginella snails collected from different regions in Puerto Rico using a direct DNA isolation method. In addition, the presence of a fosmid and insert in the clones was confirmed by restriction analysis. The libraries generated from the East, South, North and West regions of Puerto Rico averaged, respectively, 11,000 clones with 60% DNA insert, 16,700 clones with 90% DNA insert, 16,500 clones with 90% DNA insert and 16,000 clones with 100% of insert. Clones in the four libraries had a 70% insert variation/region. After determining the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) to Ampicillin (Amp, 12μg/mL), Gentamycin (Gm, 8μg/ml) and Tetracycline (Tet, 1μg/mL) of Escherichia coli Epi300 with pCC1FOS vector with no insert as control; the Metagenomic Libraries generated were spread on LB plates with MICs ranging from 1X-7X. Clones from all four libraries showed AR to Amp (too numerous to count) for 1X and 2X, AR for 1X Tetracycline in the North, East, West libraries, and 1X-2X in the South; and for Gm, resistant clones were found only in MIC 1X for the east region. The clones from the four libraries resistant to Ampicillin showed similar band patterns. After transposon mutagenesis, the in silico analysis at amino acid level suggested the presence of sequences with homology to: Histidine Kinase, Thymidylate Synthase, and Phosphoenolpyruvate Carboxykinase. These findings proposed functional multidrug resistance in C. marginella clones is due to membrane transport mechanism by efflux pump. This study is the first metagenomic AR study in a snail gut in Puerto Rico and Caribbean, and represents the first steps in gaining a better understanding of C. marginella gut microbiome resistome.

El incremento en resistencia a los antibióticos (AR) es uno de los problemas de salud pública más importantes a nivel mundial. El incremento en los casos de AR ha sido observado a nivel global. Por tanto, necesitamos usar y analizar técnicas no tradicionales para solucionar este problema. El uso de la metagenómica como un enfoque independiente de cultivo se ha convertido en una técnica poderosa, usada en el análisis de microbiomas y que ha facilitado el descubrimiento de nuevas actividades, incluyendo AR en diversos ambientes. Estudios recientes han subestimado la diversidad microbiana y genotípica en el microbioma de los caracoles. Caracolus marginella es un caracol terrestre nativo de las islas del Caribe, con una gran capacidad de adaptación a distintos ambientes y cuyo potencial biomédico permanece inexplorado. Treinta (30) especímenes fueron colectados de cinco lugares de muestreo, en las cuatro regiones de la isla. Nuestra investigación se enfoca en estudiar de manera cultivable y no cultivable el microbioma de C. marginella. Con el fin de lograr esta meta, 34 microorganimos (bacterias y levaduras) fueron identificados del intestino. Estos fueron microbiológicamente caracterizados (macro y microscópicamente) y posibles aplicaciones biotecnológicas fueron estudiados para detectar la degradación de celulosa y almidón. De estos organismos aislados, el 61.7% y el 8.8% fueron positivos para la degradación de celulosa y almidón, respectivamente. Cuatro bibliotecas metagenómicas del microbioma presente en el intestino de C. marginella de cuatro diferentes regiones de Puerto Rico fueron generadas y analizadas para detectar actividad de resistencia a antibióticos. Cuatro bibliotecas metagenómicas de alto peso molecular (40kb) fueron generadas del intestino de C. marginella colectados de las distintas regiones de Puerto Rico usando un método directo de extracción de DNA. La presencia de fósmido e inserto en los clones fue confirmada usando un análisis de restricción enzimática. Las bibliotecas generadas del Este, Sur, Norte y Oeste tienen un promedio de 11,000 clones con un 60% de inserto de ADN, 16,700 clones con 90% de inserto de ADN, 16,500 clones con 90% de inserto de ADN y 16,000 con un 100% de inserto de ADN, respectivamente. Los clones en las cuatro bibliotecas presentan una variabilidad de un 70%. Luego de determinar la Concentración Mínima de Inhibición (MIC) de ampicilina (Amp, 12μg/mL), gentamicina (Gm, 8μg/ml) y tetraciclina (Tet, 1μg/mL) de Escherichia coli Epi300 con y sin el vector pCC1FOS, y con inserto como control; las bibliotecas metagenómicas fueron cultivadas en platos de LB con un rango de MICs 1X-7X. Clones de las cuatro bibliotecas presentaron AR a Amp, muchos para ser contados en 1X y 2X, AR para 1X de tetraciclina en las bibliotecas del Norte, Este y Oeste, y para 1X-2X en la del Sur. En el caso de gentamicina sólo se encontró AR en clones de la biblioteca del Este. Los clones resistentes a ampicilina de las cuatro bibliotecas presentaron el mismo patrón de bandas. Un análisis in silico fue llevado acabo usando mutagénesis por transposón. El análisis in silico llevado a cabo a nivel de amino ácidos reveló secuencias homólogas a enzimas como: quinasa de histidina, sintetasa de timidilato, y carboxiquinasa de fosfoenolpiruato. Todas estas enzimas están relacionadas estrechamente con un mecanismo de transporte membranal llamado “efflux pump”, envuelto en la capacidad de resistencia a múltiples drogas. Este estudio representa los primeros pasos para ganar un mejor entendimiento en el resistoma del intestino de C. marginella.