Transcriptome data analysis of the Millepora (Hydrozoa: Milleporidae) species complex in Puerto Rico

Abstract

Millepora is a relative rich-species genus of hydrocorals, with 18 species distributed around the globe and no shared species between the Atlantic and Pacific Ocean. It is considered one of the important reef building cnidarians. The current diversity of the Caribbean Millepora species consist of Millepora complanata, M. alcicornis, M. squarrosa and M. striata but there are century-old taxonomic uncertainties. Here, we report the de-novo transcriptome assembly and phylotrascriptomic analysis of M. alcicornis, M. complanata, M. squarrosa and a new ecomorph (Millepora sp.) found in exposed, shallow water, Thalassia beds and mangrove areas in southwest Puerto Rico. We obtained over 345 million reads from the transcriptomes of the four taxa (Illumina HiSeq4000; 2x150bp). The analysis pipeline consisted of assembly with Trinity, BUSCO for quality check, RSEM for TPM filtration, and ORF call for each transcriptome, prior to ontology and phylogenetic analysis. The ontology analysis was performed using Blast2GO, and genes were categorized by molecular functions, biological processes, and cellular components. The phylogenetic analysis was performed using distinct custom bash programs to select homologous sequences among the transcriptomes, resulting in 10,797 homologous sequences. The concatenation analysis (with either Maximum Likelihood or Bayesian inference) resulted in a topology supporting a clade of M. complanata and M. alcicornis; with Millepora sp., the ecomorph, outside the clade, and M. squarrosa as the outgroup. However, in a coalescence-based tree estimation analysis (using RAxML and ASTRAL-II), a different topology resulted, with M. alcicornis forming a clade with Millepora sp. rather than with M. complanata. ASTRAL-II analysis indicated that there is a very high degree of incomplete lineage sorting, suggesting a very recent time of divergence among these three out of the four Caribbean Millepora species. Of the three Caribbean species and the ecomorph considered in this analysis, M. squarrosa, is the only species that can be differentiated readily as a genetically distinct milleporid species.

Millepora es un género relativamente rico en especies, con 18 especies de hydrocorales reconocidos y distribuidos alrededor del mundo, pero sin especies compartidas entre el Océano Atlántico y el Océano Indo-Pacífico. Dentro de los cnidarios, el género Millepora es considerado un constructor importante de arrecifes. Las especies reconocidas de Millepora en el Caribe son Millepora complanata, M. alcicornis, M. squarrosa y M. striata, pero aun después de muchos años, todavía existen dudas y problemas con la taxonomía de algunas especies. Este estudio presenta nueva información a partir del ensamblaje de-novo del transcriptoma y filo-transcriptoma de tres de las especies comunes en Puerto Rico, M. alcicornis, M. complanata, M. squarrosa, y un nuevo ecomorfo (Millepora sp.) encontrado en el área somera, expuesta de Thalassia y manglares en el suroeste de Puerto Rico. Se obtuvieron más de 345 millones de secuencias de los trasncriptomas de las tres especies y el nuevo ecomorfo de Millepora (Illumina HuSeq4000; 2x150bp). El flujo del análisis consistió en el ensamblaje del transcriptoma en Trinity, se verificó la calidad con BUSCO, RSEM para filtrar por TPM, y buscar los Marcos de Lectura Abiertos en los transcriptomas antes del análisis de ontología y filogenia. Se utilizó Blast2Go para hacer el análisis de ontología y los genes fueron clasificados por función molecular, procesos biológicos y componentes celulares. El análisis filogenético se realizó utilizando distintos programas en “bash” para seleccionar las secuencias homólogas entre los transcriptomas, dando como resultado 10,797 secuencias homólogas. El análisis de concatenación (Máxima Verosimilitud e Inferencia Bayesiana) resultó en una homología respaldando un clado con M. complanata y M. alcicornis, con Millepora sp. fuera del clado y M. squarrosa como el grupo externo más diferente. Sin embargo, el análisis de incorporación basado en la evaluación de árboles filogenéticos (utilizando RAxML y ASTRAL-II), resultó en un esquema distinto, con M. alcicornis formando un clado con Millepora sp. en lugar de que con M. complanata. El análisis de ASTRAL-II indicó que hay un alto grado de clasificación incompleta del linaje, sugiriendo que tres de las cuatro especies de Millepora divergieron recientemente. La cuarta especie, M. squarrosa es la única que se puede diferenciar como una especie aparte.