Nanopore sequencing for the metagenomic analysis of the gut microbiota of the millipede Anadenobolus monilicornis

Abstract

Millipedes act as important components of leaf litter decomposition in terrestrial ecosystems, thanks in part to the microbial diversity in their guts. However, millipedes and their gut microbiota are understudied, compared to other arthropods. For this reason, we designed a protocol for the extraction, sequencing, and shotgun metagenomic analysis of the gut of Anadenobolus monilicornis. We collected specimens of A. monilicornis from different municipalities of Puerto Rico. We extracted their guts and sequenced the DNA with Oxford Nanopore Technologies’ MinION nanopore sequencer, then analyzed the data using the programs Phylosift and MEGAN6, and the MG-RAST online server. From our two successful samples from the municipalities of Mayagüez and Rincón, we obtained a total of 87,110 and 99,749 reads, respectively. We found that many of our assigned bacteria reads were annotated to the phyla Proteobacteria, Bacteroidetes, and Firmicutes; the Mayagüez sample had much more Chlamydiae representation, however. Sampled eukaryote phyla include Arthropoda, Streptophyta, and Chordata. Judging by the fact that some of the reads were annotated as belonging to Chordata, coupled with the lack of Nematoda and Ascomycota reads, we concluded that some missannotation may have occurred. We would need a larger sample size to better identify the intestinal microbial taxa, as we were setback by the landfall of Hurricane Maria in 2017. Considering our small sample size, however, we were able to develop an initial fingerprint of the millipede intestinal microbiota using shotgun metagenomics and nanopore sequencing.

Los milpiés actúan como componentes importantes de la descomposición de la hojarasca en los ecosistemas terrestres, debido en parte a la diversidad microbiana que se encuentra en sus intestinos. Sin embargo, los milpiés y su microbiota intestinal no han sido estudiados tanto como en otros grupos de artrópodos. Por esta razón, desarrollamos un protocolo de extracción, secuenciación y análisis metagenómico del intestino de Anadenobolus monilicornis. Colectamos especímenes de A. monilicornis de diferentes municipios de Puerto Rico. Extrajimos sus intestinos y secuenciamos su ADN usando el secuenciador de nanoporos MinION de Oxford Nanopore Technologies, para luego analizar los datos usando los programas Phylosift y MEGAN6, y el servidor en línea MG-RAST. De las dos muestras exitosas, una de Mayagüez y otra de Rincón, obtuvimos un total de 87,110 y 99,749 lecturas de ADN, respectivamente. Encontramos que la mayoría de las lecturas asignadas a bacterias pertenecían a los filos Proteobacteria, Bacteroidetes, y Firmicutes; la muestra de Mayagüez tuvo mucha más representación de Chlamydiae. Algunos filos eucarióticos muestreados incluyen Arthropoda, Streptophyta, Chordata. Juzgando por el hecho de que obtuvimos lecturas asignadas a Chordata, además de la falta de lecturas de Nematoda y Ascomycota, llegamos a la conclusión que alguna anotación incorrecta de lecturas pudo haber ocurrido. Necesitaríamos una muestra más grande para mejor determinar los taxones microbianos intestinales, ya que nuestros planes fueron afectados por el paso del Huracán María de 2017. Considerando nuestro tamaño de muestreo pequeño, sin embargo, logramos desarrollar un perfil inicial de la microbiota intestinal de un milpiés usando metagenómica “shotgun” y secuenciación de nanoporos.