Sigatoka disease complex of Musa spp. in Puerto Rico and the development of a transformation vector for Pseudocercospora fijiensis to examine the avirulence 4 (PfAvr4) effector during infection of Musa spp.

Abstract

Bananas and plantains (Musa spp.) are among the world’s most economically important crops. Worldwide, the most important fungal leaf diseases of Musa spp. are the Sigatoka disease complex, comprised of the black leaf streak (Pseudocercospora fijiensis), the Sigatoka leaf spot (P. musae), and the Eumusae leaf spot (P. eumusae). This last species has not been reported in the Western Hemisphere. Considering the rapid rate of spread of black Sigatoka in Puerto Rico after its first observation in 2004, and the potential threat to Musa spp. by P. eumusae, the first objective of this study was to reassess the Sigatoka disease complex in the island. Sixty-one leaf samples were collected from thirteen municipalities around the island showing Sigatoka-like symptoms. Leaf samples were placed on petri-dish humid chambers for 24 h to establish monosporic cultures, colony morphology was recorded and described by stereoscopic and microscopic observations and measurements. Genomic DNA was extracted from leaf samples and fungal colonies. PCR amplifications were performed using universal and species-specific primers. To support fungal identification, amplicons were sequenced and analyzed by constructing Maximum- Likelihood (RAxML) phylogenetic trees. Fifty leaf samples amplified with P. fijiensisspecific primers, P. musae, and P. eumusae were not detected, suggesting that Black Sigatoka has displaced the Yellow Sigatoka disease in the island. Fungal isolates were identified as P. fijiensis (n=24), Cladosporium spp. and Cladosporium-like spp. (n=4), C. dominicanum (n=1), Neocordana musae (n=2), Zasmidium spp. (n=6), and Z. musigenum (n=1). Other fungi identified from the Musa spp. samples belong to the genus Zygophiala sp. and Deightoniella sp. but were not successfully isolated. The second objective of this study focuses on the virulence factors produced by P. fijiensis to colonize Musa spp. and understanding their plant-pathogen interactions which remain unclear. For this reason, we developed a transformation vector to study P. fijiensis using the green fluorescent protein (GFP) to examine potential virulence factors during the infection processes. We compared P. fijiensis infection process on leaf sheaths and undetached leaves. The leaf sheath inoculation method was the best approach to study P. fijiensis infection process, revealing pseudohyphal-like bulbous invasive hyphae that have never been described before for this pathogen. Designed primers successfully amplified the PfAvr4 gene of P. fijiensis. A transformation vector based on the Agrobacterium tumefaciens pBHt2 plasmid was developed to evaluate PfAvr4 expression with an enhanced GFP (EGFP). The leaf sheath inoculation method and transformation approaches employing the vector developed in this study could be used to elucidate effector interactions in the Sigatoka pathogens when colonizing Musa spp. Accurate identification of species causing leaf diseases in Musa spp. will allow establishing quarantine regulations and specific management approaches in Puerto Rico. Furthermore, understanding molecular plant-pathogen interactions of these very important fungal pathogens will contribute to the development of new management strategies.

Económicamente, los plátanos y guineos (Musa spp.) se encuentran entre los cultivos más importantes del mundo. A nivel mundial, las enfermedades foliares fúngicas más limitantes de Musa spp. corresponden al complejo de Sigatoka que se compone de Sigatoka negra (Pseudocercospora fijiensis), Sigatoka amarilla (P. musae) y mancha foliar Eumusae (P. eumusae). Esta última enfermedad no ha sido reportada en el hemisferio occidental. Considerando la rápida tasa de dispersión de la Sigatoka negra en Puerto Rico después de su primera observación en 2004, y la amenaza potencial de P. eumusae para la producción de Musa spp., el primer objetivo de este estudio fue revaluar la presencia del complejo de Sigatoka en la isla. Se recolectaron sesenta y una muestras de hoja con síntomas similares a los de Sigatoka en trece municipios alrededor de la isla. Las muestras de hojas se desinfectaron superficialmente y se colocaron en cámaras húmedas de placa Petri durante 24 h para establecer cultivos monospóricos que fueron descritos por observaciones y mediciones mediante estereoscopio y microscopio. Se extrajo ADN genómico de las muestras de hojas y colonias de hongos. Las amplificaciones por PCR se realizaron utilizando cebadores universales y específicos para Pseudocercospora spp. Para confirmar la identificación, se secuenciaron y construyeron árboles filogenéticos de Maximum- Likelihood (RAxML). Cincuenta muestras de hojas amplificaron con los cebadores específicos de P. fijiensis, pero P. musae y P. eumusae no fueron detectados indicando que la Sigatoka negra pudo haber desplazado a la Sigatoka amarilla en la isla. Los aislados identificados asociados a Musa spp. fueron P. fijiensis (n=24), Cladosporium spp. y especies similares a Cladosporium spp. (n=4), C. dominicanum (n=1), Neocordana musae (n=2), Zasmidium spp. (n=6) y Z. musigenum (n=1). Otros hongos identificados asociados a Musa spp. pertenecían a los géneros de Zygophiala sp. y Deightoniella sp. pero no se lograron aislar. El segundo objetivo de este estudio se enfocó en los factores de virulencia producidos por P. fijiensis para colonizar Musa spp. y comprender las interacciones plantapatógeno que aún se desconocen. Por esta razón, desarrollamos un vector de transformación para estudiar P. fijiensis utilizando la proteína verde fluorescente (EGFP) para examinar los posibles factores de virulencia durante los procesos de infección. Comparamos el proceso de infección de P. fijiensis en segmentos de pseudotallo y hoja de Musa spp. El método de inoculación de pseudotallo fue el mejor método para estudiar el proceso de infección por P. fijiensis, revelando una hifa invasiva de forma bulbosa que nunca se había descrito para este patógeno. Los cebadores diseñados amplificaron con éxito el gen PfAvr4 de P. fijiensis para el cual se desarrolló un vector de transformación basado en el plásmido pBHt2 de Agrobacterium tumefaciens para evaluar la expresión de PfAvr4 con EGFP durante el proceso de invasión en planta. El desarrollo en este estudio de un método de inoculación de pseudotallo y el vector de expresión para PfAvr4: EGFP podrían usarse para dilucidar la interacción planta-patógeno durante la infección. La identificación correcta de las especies que componen el complejo de Sigatoka en Musa spp. permitirá establecer regulaciones de cuarentena y enfoques específicos para su control en Puerto Rico. Además, la comprensión de las interacciones moleculares planta-patógeno de estos hongos fitopatógenos contribuirá al desarrollo de nuevas estrategias para su control.