Identificación de Pseudocercospora fijiensis mediante amplificación isotérmica mediada por bucle

Abstract

El mayor ingreso agrícola en Puerto Rico proviene de los cultivos farináceos, siendo los bananos y plátanos los principales cultivos de este grupo. Las musáceas se ven afectadas por muchos patógenos, pero la enfermedad más limitante en la producción es la sigatoka negra. El hongo hemibiotrófico Pseudocercospora fijiensis es el agente causal de la sigatoka negra. Este patógeno coloniza la planta a través de los estomas y, una vez que la infecta, comienza a necrotizar el tejido. El manejo de la sigatoka negra se basa principalmente en la aplicación continua de fungicidas, aumentando los costos de producción tanto para los agricultores como para los consumidores. La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) utiliza de cuatro a seis cebadores y una polimerasa con actividad de desplazamiento para amplificar el ADN. El uso de una polimerasa con actividad de desplazamiento permite que la reacción se lleve a cabo a temperaturas constantes, evitando costosos equipos de laboratorio. LAMP no requiere equipo de laboratorio especializado; solo necesita una fuente de calor constante. Esto permite realizar la técnica en el campo utilizando equipos portátiles. Esta investigación tiene como objetivo desarrollar un ensayo LAMP para identificar a P. fijiensis. Esta investigación también examinará el efecto de los medios de cultivo PDA y PDB en el crecimiento y la esporulación de P. fijiensis bajo luz roja. La optimización de LAMP evaluó diferentes parámetros, como el número de cebadores, la concentración de los cebadores y el tiempo de incubación. Además, se comparó la sensibilidad de LAMP con la técnica de PCR convencional. La especificidad de LAMP se evaluó con otros hongos fitopatógenos de diferentes géneros. Las condiciones óptimas para la amplificación mediada por LAMP fueron el uso de seis cebadores a una concentración final de 0.25x durante 20 minutos. Al aumentar el tiempo de incubación, LAMP pudo amplificar muestras de ADN con concentraciones de 1 x 10-2 ng/μl. No se observó amplificación en ninguno de los géneros de hongos analizados, lo que demuestra la especificidad del ensayo LAMP desarrollado. Finalmente, esta técnica pudo identificar P. fijiensis a partir de tejido micelial y tejido vegetal infectado con diferentes niveles de severidad. Un ensayo LAMP para detectar P. fijiensis en plantas enfermas en diferentes grados de severidad, con alta sensibilidad y especificidad, fue validado con éxito con un tiempo de amplificación de 60 minutos. A los 14 días, el crecimiento de P. fijiensis fue significativamente mayor en el medio PDA que en PDB. Sin embargo, después de 21 días, no hubo diferencia significativa en el crecimiento de ambos medios de cultivo. En ninguno de los medios de cultivo se observaron conidios.

The largest agricultural income in Puerto Rico comes from starchy crops, with bananas and plantains being the main crops in this group. Musaceae are affected by many pathogens, but the most limiting disease in banana production is black sigatoka. The hemibiotrophic fungus Pseudocercospora fijiensis is the causal agent of black sigatoka. This pathogen colonizes the plant through the stomata and, once it infects it, begins to necrotize the tissue. The management of black sigatoka is based mainly on the continuous application of fungicides, increasing production costs for both farmers and consumers. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) uses four to six primers and a polymerase with displacement activity to amplify DNA. Using a polymerase with displacement activity allows the reaction to be carried out under constant temperatures, avoiding expensive lab equipment. LAMP does not require specialized laboratory equipment; it only needs a constant heat source. This allows the technique to be carried out in the field using portable equipment. This research aims to develop a LAMP assay to identify P. fijiensis. This investigation will also examine the effect of PDA and PDB culture media on the growth and sporulation of P. fijiensis under red light. LAMP optimization evaluated different parameters such as the number of primers, primer's concentration, and incubation time. Additionally, the sensitivity of LAMP was compared with the conventional PCR technique. The specificity of LAMP was evaluated with other phytopathogenic fungi of different genera. The optimal conditions for LAMP-mediated amplification was using six primers at a final concentration of 0.25x for 20 minutes. By increasing the incubation time, LAMP was able to amplify DNA samples with concentrations of 1 x 10-2 ng/μl. No amplification was observed in any of the fungal genera tested, demonstrating the specificity of the LAMP assay. Finally, this technique was able to identify P. fijiensis from mycelial tissue and infected plant tissue with different levels of severity. A LAMP assay for detecting P. fijiensis in diseased plants at different degrees of severity, with high sensitivity and specification, was successfully validated with an amplification time of 60 minutes. At 14 days, the growth of P. fijiensis was significantly higher in the PDA medium than in PDB. However, after 21 days, there was no significant difference in the growth of both culture media. In neither of the culture media, conidia were observed.