Detection and identification of Cryptococcus neoformans/gattii complex in novel environmental samples using physiological and genetic tools

Abstract

Cryptococcus neoformans/gattii complex (C.neo/gat) are opportunistic, encapsulated yeasts that adversely affect primarily immune-suppressed patients. The yeasts live freely in the environment, mainly associated to pigeon droppings and to eucalyptus, almond or other tree detritus. At present, the varieties belonging to C.neo/gat have been divided into two species according to their environmental niches and to physiological and molecular differences. Few studies on the ecology of C.neo/gat have been conducted in Puerto Rico. Therefore, we decided to determine the presence of the yeast on novel and diverse environmental sources. Detritus and surface samples from trees and succulent plants from western Puerto Rico were collected as well as pigeon droppings. The C.neo/gat isolates were preliminarily identified by melanin production on Niger Seed Agar. The identity of the isolates was confirmed using microscopical and biochemical tests and by the in silico analysis of the small ribosomal subunit 18S rDNA, intergenic spacer (IGS) and internal transcribed spacer (ITS) of the isolates. Genetic differences between the isolates were identified by a phylogenetic analysis using the 18S rDNA sequences, showing five homology groups. Also, strains and environmental isolates from Puerto Rico, belonging to the C.neo/gat complex, were analyzed using the BIOLOG Microstation System, to identify five specific common carbon sources for members of C. neo/gat. This research also included a preliminary phage display analysis. Through the interaction of C. gattii C77 strain with human brain and lung genomic libraries fused on the T7 phage, it was determined that two main peptides, which coded to nectin and telecephalin, interacted. The peptides can potentially serve as vaccine precursors to develop as a new anticryptococcal therapy and also be used to identify the interaction of the capsule with the target organs. To the best of our knowledge, the findings present in this research correspond to the first report ever on the isolation of C. gattii from cacti, and from tree detritus in Puerto Rico. Also, this research corresponded to the first study of the reliability of the BIOLOG Microstation System for the rapid identification of the C. neo/gat complex and on the interaction of whole cells of C. gattii to T7 premade human genomic libraries of lung and brains.

El complejo Cryptococcus neoformans/gattii (Cneo/gat) está compuesto de levaduras oportunistas, encapsuladas que afectan principalmente a pacientes inmunocomprometidos. Estas levaduras viven en el ambiente, asociadas a excreta de paloma y a detrito de árboles de eucaliptos, almendros y de otros. Actualmente, las variedades pertenecientes a Cneo/gat han sido divididas en dos especies de acuerdo a sus diferencias en nichos ecológicos, fisiología y biología molecular. En Puerto Rico se han realizado muy pocos estudios sobre la ecología de C.neo/gat. Es por esto que se ha decidido determinar la presencia de la levadura en diversas y noveles fuentes ambientales. Se colectaron y procesaron detritos y superficies de árboles y plantas suculentas del área oeste de Puerto Rico, y también se colectaron muestras de excreta de paloma. Los aislamientos de C.neo/gat fueron identificados preliminarmente mediante la producción de melanina en Niger Seed Agar. La identidad de los aislamientos fue confirmada mediante el uso de pruebas bioquímicas y por el análisis in silico de la subunidad ribosomal pequeña 18S rDNA, espacio intergénico (IGS, por sus siglas en inglés) y por el espacio interno transcrito (ITS, por sus siglas en inglés). Las diferencias genéticas entre los candidatos fueron identificadas por análisis filogenético usando las secuencias del 18S rDNA, lo que mostró 5 grupos homólogos. Además, las cepas de C. neo/gat A, B, C and y algunos aislamientos ambientales pertenecientes al complejo de C.neo/gat, fueron analizados usando el Sistema BIOLOG Microstation. En esta investigación también se incluye un análisis preliminar usando la tecnología “T7 phage display”. Por la interacción de células de C. gattii con bibliotecas genómicas de cerebro y pulmón fusionadas al bacteriófago T7, se lograron aislar dos péptidos recombinantes principales, nectina y telecefalina, los cuales interaccionan con la cápsula de la levadura. Estos péptidos recombinantes pueden ser usados como posibles precursores de una vacuna contra criptococosis y para identificar la interacción de la cápsula de C. gattii con los órganos blancos. Al mejor de nuestros conocimientos, los hallazgos descritos en esta investigación representan el primer reporte del aislamiento de C. gattii de cactus en la literatura mundial, y de detritos de árboles en Puerto Rico. Además, esta investigación corresponde el primer estudio de la que prueba la confiabilidad del Sistema BIOLOG Microstation para la identificación rápida del complejo C. neo/gat y de la interacción de células completas de C. gattii con bibliotecas genómicas prefabricadas de cerebro y pulmón codificas en el bacteriófago T7.