Crystallographic structures of hemoglobin II (HbII) from Lucina Pectinata in the 4–9 pH range

Abstract

Lucina pectinata’s ctenidia contains three hemeproteins: the hydrogen sulfide reactive hemoglobin I (HbI) and the oxygen transporting hemoglobins II and III (HbII and HbIII) that remain unaffected by the presence of H2S. The mechanism for ligand discrimination used by these hemeproteins, their function and ligand selection and stabilization remain unknown. The distal pocket composition of HbII contains TyrB10 and GlnE7 residues. They could contribute to the ligand stabilization with a hydrogen bond network between the ligand and the residues. Also, the heme group of HbII is buried, compared to HbI, within the protein matrix. The synergetic effects of HbII’s heme pocket size, in combination with the hydrogen bonding network and the orientation of the heme–oxygen complex, confer stability to this heme derivative. The pH could produce rearrangements in the heme pocket of the protein and also trigger changes on its native structure and functionality. In this work, crystals of oxy–HbII at different pHs were obtained and their x-ray diffraction collected using the synchrotron radiation facilities in Grenoble, France. The corresponding crystallographic structures were used to evaluate the structural changes induced by pH, particularly around the TyrB10 and GlnE7 residues. Oxy–HbII crystals were grown at different pH values by the capillary counterdiffusion (CCD) technique, using a two–step protocol. A mini screen (first step) was used to validate sodium formate as the best precipitating reagent to grow oxy–HbII crystals. The second step, a pH screen typically used for optimization, was used to produce the crystals in the pH range from 4 to 9. Very well faceted prismatic ruby–red crystals were obtained at all pH values. X-ray diffraction data sets were acquired using synchrotron radiation of wavelengths of 0.886 Å (at pH 5) and 0.908 Å (at pH 4, 8 and 9) to a maximum resolution of 3.30, 1.95, 1.85 and 2.00 Å for pH 4, 5, 8 and 9, respectively. All crystals obtained were isomorphous, belonging to the P42212 space group. The four crystallographic structures were solved and uploaded to the RCSB Protein Data Bank, each receiving the following PDB codes: 3PI4 for pH4, 3PI3 for pH5, 3PI2 for pH8 and 3PI1 for the pH9 structure. The crystallographic results suggest the pH effect is a possible driving force for a conformational change in the HbII protein structure, specifically in the vicinity of the distal region. The orientation of the peripheral vinyls and propionate groups was also affected by pH. Slight changes were observed in the rearrangement of the hydrogen bond network of the TyrB10 and GlnE7 with the oxygen molecule at the heme pocket of HbII at pH5, 8 and 9. The structure at pH4 presents a porphyrin ring deformation as consequence of the entrance of a water molecule to the distal site. This produced a metaquo–HbII complex as consequence of the heme iron oxidation (Fe+2 -> Fe+3). The overall structures for Lucina pectinata HbII evidenced slight variations in the secondary structure as a function of pH, but the integrity of the classical 3–over–3 protein globin fold remained unaffected. Finally, the crystallographic results in the particular oxy–heme TyrB10–GlnE7 moiety suggest a mechanism for oxygen dissociation from the heme group by the relevance of the pH effect at the heme pocket residues. Specifically, as the pH range decrease from 9 to 5, the Fe–O2 bond weakens as the bond length increase from 1.8 Å to 2.0 Å. This suggests that the conformation and amino acids protonation changes are a pathway for the release of the oxygen molecule in these systems. The result indeed confirms the predominant role of the TyrB10 in the stabilization and dissociation of the oxy–heme ligand complex in hemeproteins.

La “ctenidia” de Lucina pectinata alberga tres hemoproteínas: la hemoglobina I reactiva a sulfuro de hidrógeno (HbI) y las hemoglobinas II y III transportadoras de oxígeno (HbII y HbIII) las cuales se mantienen oxigenadas en presencia de H2S. Sin embargo, el mecanismo para la estabilización del ligando utilizado por estas hemoproteínas, su función y la selección y estabilización del ligando es aún desconocido. La composición del bolsillo distal de HbII contiene los residuosTyrB10 y GlnE7. Estos pueden contribuir con la estabilización del ligando mediante una red de puentes de hidrógeno entre el ligando y los residuos. También el grupo hemo de HbII está oculto, en comparación con HbI, en la matriz protéica. El efecto sinergético entre el tamaño del bolsillo del hemo de HbII en combinación con la red de puente de hidrógeno y la orientación del oxígeno en el complejo le confiere estabilidad a este derivado. El pH puede generar rearreglos en el sitio activo de la proteína y propiciar cambios en la estructura nativa y la funcionalidad. En este trabajo, se obtuvieron cristales de oxy–HbII a diferentes pHs y se recopilaron datos de difracción de rayos X utilizando las facilidades de radiación de sincrotrón en Grenoble, Francia. Las correspondientes estructuras cristalográficas se utilizaron para evaluar cambios estructurales inducidos por el pH, particularmente alrededor de los residuos de TyrB10 y GlnE7. Se crecieron cristales de oxy–HbII mediate la técnica de contradifusión capilar (CDC) a diferentes pHs empleando un protocolo en dos pasos. Se utilizó un barrido pequeño (primer paso) para la validación del formato de sodio como mejor agente precipitante para crecer cristales de oxy–HbII. En el segundo paso, un barrido en pH típicamente usado para optimización, fue utilizado para producir cristales en el rango de pH de 4 a 9. Se obtuvieron cristales prismáticos facetados color rubí a todos los valores de pH. Los datos de difracción de rayos X fueron adquiridos utilizando radiación de sincrotrón de largo de onda 0.886 Å (pH 5) y 0.908 Å (pH 4, 8 and 9) a una resolución máxima de 3.30, 1.95, 1.85 y 2.00 Å para pH 4, 5, 8 y 9, respectivamente. Todos los cristales obtenidos son isomorfos pertenecientes al grupo espacial P42212. Las cuatro estructuras cristalográficas fueron resueltas y puestas en el Banco de Datos de Proteínas RCSB, recibiendo cada una el siguiente código PDB: 3PI4 para pH4, 3PI3 para pH5, 3PI2 para pH8 y 3PI1 para pH9. Los resultados cristalográfica sugiere que el efecto en pH es la posible fuerza motriz para un cambio conformacional en la estructura de la proteína HbII, específicamente en la vecindad de la región distal. Las orientaciones de los grupos periferales vinilo y propionato también son afectadas por el efecto del pH. Se observaron cambios pequños en el rearreglo de la red de puente de hidrógeno entre la TyrB10 y la GlnE7 con la molécula de oxígeno en el bolsillo del hemo a pH5, 8 y 9. La estructura a pH4 presenta una deformación en el anillo de la porfirina a consecuencia de la entrada de una molécula de agua al sitio distal. Esto produce el complejo metaquo–HbII como consecuencia de la oxidación (Fe+2 -> Fe+3) del hierro del hemo. Las estructuras cristalográficas para HbII de Lucina pectinata evidencia variaciones pequeñas en la estructura secundaria como función del pH, pero la integridad del plegamiento clásico 3–sobre–3 de una proteína globular no es afectado. Finalmente, los resultados cristalográficos entre los residuos TyrB10–GlnE7 del oxy–hemo sugieren un mecanismo para la disociación de oxígeno del grupo hemo dada la relevancia del efecto en pH en los residuos del bolsillo del hemo. Específicamente, a medida que el rango en pH disminuye de 9 a 5, el enlace Fe–O2 se debilita a medida que aumenta el largo de enlace de 1.8 Å a 2.0 Å. Esto sugiriere que cambios en conformación y en la protonación de amino ácido son la ruta para la disociación de la molécula de oxígeno de estos sistemas. De hecho, el resultado confirma el rol predominante de la TyrB10 en la estabilización y disociación del ligando en complejos oxy–hemo en hemoproteínas.