New crystallographic structures of Oxy-HbII-III and CN-HbII-III forms from Lucina pectinata

Abstract

The clam Lucina pectinata is found in the sulfide-rich southwest coastal sediments of La Parguera, Puerto Rico in the Caribbean Sea. This bivalve mollusk has developed a chemoautotrophic symbiotic relation with the bacteria within it, with varying levels of interaction via intracellular and intercellular pathways in a sulfide-rich environment. One of the most interesting interaction paths with the bacteria takes place through the family of hemoproteins; hemoglobin I (HbI), hemoglobin II (HbII) and hemoglobin III (HbIII). The structures of HbI in its aquomet, sulfide, and cyanide forms, and the oxy form of HbII have been solved. However, the structure of native oxygen-reactive hemoglobins complex (HbII-III) has remained unsolved until now. The proteins complex was isolated and purified from its natural source and crystallized using the hanging drop vapor diffusion (HDVD) and capillary counterdiffusion (CCD) techniques. Oxy and cyano derivatives of the HbII-III were crystallized. The best crystals in terms of quality and size were obtained from sodium formate at pH 5 using the CCD technique in a single capillary. Crystals of the oxy and cyano HbII-III derivatives showed a ruby-red color and nonsingular prismatic shapes. They scattered X-rays to resolution limits of 2.15 and 1.75 Å, using a 0.901 and 0.886 Å synchrotron-radiation source, respectively. The crystals belonged to the tetragonal system, space group P42212, with unit-cell parameters a = b = 74.07, c = 152.07 and a = b = 74.13, c = 152.57 Å for the oxy and cyano HbII-III, respectively. The structures of the HbII-III are necessary to gain knowledge about the HbII and HbIII protein interactions versus HbII dimer to establish a precise interpretation as oxygen carrier proteins. Also the structures will produce inside into the oxygen selection mechanism to correlate the structures with the proposed protein function and properties of these hemoglobins from L. pectinata. The interest of the oxy-HbII-III protein complex and the cyano form provides us with better insight into the heme-iron oxidation-state effect to correlate with the ligand stabilization. The association constants comparisons indicate the accessibility effect in the ligand entrance for the HbII-III and HbII-II dimers. Both structural models, oxy-HbII-III (PDB id: 3TP7) and CN-HbII-III (PDB id: 3TP8), confirm the distal heme pockets residues for HbIII. The HbII-III structural arrangement findings support the hypothesis which establishes it as the native oxygen carrier in the organism.

La almeja Lucina pectinata se encuentra en los sedimentos ricos en azufre al suroeste de Puerto Rico en la costa de La Parguera del Mar Caribe. Este molusco bivalvo ha desarrollado una relación simbiótica quimioautotróficas con las bacterias en su interior, a diferentes niveles de interacción a través de vías intracelulares e intercelulares en un ambiente rico en azufre. Uno de los caminos más interesantes de esta interacción con las bacterias se lleva a cabo con la familia de las hemoproteínas compuesta por la hemoglobina I (HbI), la hemoglobina II (HbII) y la hemoglobina III (HbIII). Se han resuelto las estructuras de HbI en sus formas acuomet, azufre y la forma de ciano, además de la forma oxy de HbII. Sin embargo, la estructura del complejo de hemoglobinas nativa reactivo con oxígeno (HbII-III) ha permanecido sin resolverse hasta la fecha. HbII-III fue aislado y purificado a partir de su fuente natural y se cristalizó con las técnicas de difusión de vapor en el modo de gota colgante (DVGC) y con contra-difusión capilar (CDC). Los derivados oxy y ciano de la HbII-III se cristalizaron. Los mejores cristales, en términos de calidad y el tamaño, se obtuvieron en formato de sodio a pH 5, utilizando la técnica de CDC en un capilar. Los cristales de los derivados oxy y ciano de HbII-III mostraron un color rojo rubí con formas prismáticas no singulares. Fueron difractados usando rayos X con límites de resolución a 2.15 y 1.75 Å, con una fuente de radiación de sincrotrón de 0.901 y 0.886 Å, respectivamente. Los cristales pertenecen al sistema tetragonal, en un grupo espacial P42212, con parámetros para la celda unidad de a = b = 74.07, c = 152.07 y a = b = 74.13, c = 152.57 Å para HbII-III oxy y ciano, respectivamente. Estas estructuras de HbII-III son necesarias para obtener información acerca de las interacciones proteicas de HbII con HbIII y compáralas con el dímero de HbII, para establecer una interpretación precisa de estas proteínas como transportadoras de oxígeno. También las estructuras pueden proveer información acerca del mecanismo de la selección de oxígeno, con el fin de correlacionar las estructuras con la función y propiedades propuesta para estas hemoglobinas de L. pectinata. El interés en el complejo oxy-HbII-III y su forma ciano se debe a que nos proporcionará un mejor conocimiento de los efectos del estado de oxidación del hierro en el hemo y para correlacionar esto con la estabilización ligando. La comparación de las constantes de asociación evidencia el efecto en la accesibilidad de la entrada ligando para los dímeros HbII-III y HbII-II. Ambos modelos estructurales, oxy-HbII-III (Identificación BDP: 3TP7) y CN-HBII-III (Identificación BDP: 3TP8), confirman los residuos de amino ácidos en la región distal de los bolsillos del hemo en HbIII. Los hallazgos encontrados en los arreglos estructurares de HbII-III apoyan la hipótesis que lo establece como el transportador de oxígeno nativo en el organismo.