Comparative protein analysis of two human isoforms Centrin 1 and Centrin 2

Abstract

Centrin is a calcium binding protein belonging to EF-hand superfamily that is found only in eukaryotic cells from yeast to humans. Three isoforms have been identified in humans two of which are presented in this work: human centrin 1 (Hcen1) and human centrin 2 (Hcen2). Both are comprised of 172 amino acids having between them more than 80 % sequence identity. Hcen1 are localized in the central lumen of the basal bodies of the sperm and Hcen2 are mainly within centrioles. In order to know more about the structure, dynamics and relative stability we, have performed Hcen1 and Hcen2 bacterial expression, isolation, and purification; for their biophysical characterization using FT-IR spectroscopy and two dimensional correlation spectroscopy analysis. The order of events throughout the thermal perturbation was established from 1700 – 1530 cm-1 spectral region study. The thermal stability for Hcen1 is described as the follows: α-helix < β-sheets < glutamate < βturns, while for Hcen2 the thermal stability is the following: arginine < 310-helix < aspartate/glutamate < random coil < α-helix < aggregation < loops. A higher thermal stability was observed for Hcen1 than for Hcen2 and a pretransition at 1.7 – 4.8 ˚C and the onset of the transition temperature was also observed for Hcen1 at 80.5 – 84 ˚C. Unlike Hcen1, Hcen2 was observed to aggregate at the temperature range of 43 – 58 ˚C. Therefore, we were able to establish differences in stability, conformation and dynamics between these isoforms.

Centrin es una proteína enlazante de calcio perteneciente a la superfamilia de proteínas de mano EF que se encuentra solamente en células eucariotas desde levaduras hasta células humanas. De las tres isoformas que han sido identificadas en humanos, dos son presentadas en este trabajo: centrin humana 1 (Hcen1) y centrin humana 2 (Hcen2). Ambas tienen una secuencia de 172 amino ácidos con un 80% de identidad entre ellas. Hcen1 está localizada en el lumen central de los cuerpos basales del espermatozoide y Hcen2 se encuentra principalmente en los centríolos. En el interés de conocer más acerca de su estructura, dinámica y estabilidad relativa, hemos realizado la expresión bacteriana, aislamiento y purificación para su caracterización biofísica usando espectroscopia de infrarrojo con transformada de Fourier (FT-IR), así como el análisis espectroscópico de correlación bidimensional. El orden de los eventos durante la perturbación termal fué establecido analizando la región espectral 1700 – 1530 cm-1. La estabilidad termal para Hcen1 es descrita como la siguiente: α-hélice < hojas β < glutamato < vueltas β, mientras que para Hcen2 la estabilidad termal es la siguiente: arginina < hélice 310 < aspartato/glutamato < estructura desordenada< hélice α < agregación < giros. Una mayor estabilidad termal fue observada para Hcen1 con una pre-transición entre 1.7 – 4.8 ˚C así como un inicio de temperatura de transición entre 80.5 – 84 ˚C. A diferencia de Hcen1, en Hcen2 fué observada la agregación dentro del rango de temperatura de 43 – 58 ˚C. De acuerdo con estos resultados, fué posible establecer diferencias en la estabilidad, conformación y dinámica, entre estas isoformas.