Isolation of interacting peptides to Bacillus anthracis lethal toxin (LF) by T7 phage display

Abstract

During the last decade, Bacillus anthracis has reemerged as a biological weapon due to the occurrence of the first terrorist attack in U.S. soil with anthrax spores. Bacillus anthracis is the etiological agent of anthrax, a zoonotic deadly disease. The pathogenicity and virulence reside in the presence of a capsule and a three component protein exotoxin. The three components of anthrax exotoxin are the protective antigen (PA), the lethal factor (LF) and the edema factor (EF). The anthrax lethal factor is a protease that cleavage several isoforms of mitogen-activated protein kinase kinase (MAPKK). It is not yet known if the cleave sites of LF are exclusive to MAPKK, granting opportunities to map new interacting partners. In order to search for such interactions, functional proteomics and combinatorial chemistry approaches such as phage display have been developed using biomolecules of interest as main targets. T7 phage display system is an in vitro technique where a peptide is genetically fused to a coat protein of a bacteriophage to identify polypeptides by affinity selection, and has been used to identify novel interacting proteins of several pathogens. The main purpose of this research was to identify interacting partners to LF by T7 phage display. Four different screenings of human cDNA libraries from brain, heart, liver and lungs were performed using two variants of LF, a wild type and a mutant, as targets. Three rounds of biopanning were done to isolate phage particles displaying peptides with affinity to LF. The DNA of 380 phages was isolated and the cloned fragments amplified by PCR. The size of the clones varied between 400 and 1000 base pairs. In silico analysis of 161 sequenced fragments was done to search for the displayed peptides homologies and identities using available databases. Some of the predicted peptides sequences encode for kinases, phosphorylation proteins, tafazzin and ferritin. Also, specificity tests were done using different concentrations of LF, and other targets such as bovine serum albumin, ribonuclease and lysozyme. The results suggested that the peptides recognized and bound specifically only to LF. Interacting peptides isolated in this study will serve as baseline to understand new possible paths and interacting partners of pathogenicity, allowing the development of biomarkers, as well as blocking agents to the anthrax toxin action, pursuing new vaccines prototypes.

Durante la última década, Bacillus anthracis ha tomado importancia como arma biológica debido al primer ataque terrorista registrado en territorio de EE.UU con esporas de ántrax. Bacillus anthracis es el agente etiológico del ántrax, una enfermedad zoonótica mortal. La patogenicidad y virulencia de este organismo reside en la presencia de una cápsula y tres componentes exotóxicos. Las tres proteínas de la exotoxina del ántrax son: el antígeno protector (PA), el factor letal (LF) y el factor edémico (EF). El factor letal de ántrax es una proteasa que reconoce varias formas de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPKK). Aun existen interrogantes si los sitios reconocidos por LF son exclusivamente regiones de MAPKK. Por lo tanto la búsqueda de nuevos sitios de interacción de LF en células eucariotas es necesaria. El sistema de T7 phage display, es una técnica in vitro en la cual un péptido es genéticamente fusionado a una proteína de la cubierta del bacteriófago para identificar polipéptidos por afinidad. El objetivo principal de esta investigación fue identificar nuevas interacciones de LF utilizando la tecnología T7 phage display. Se realizaron cuatro pruebas de detección utilizando diferentes bibliotecas genómicas de ADN de cerebro, corazón, hígado y pulmones. Se utilizaron dos variantes de la toxina de ántrax, una silvestre y una mutante para encontrar sitios nuevos de interacción. Tres rondas de bio-amplificación se llevaron a cabo donde fueron aislados fagos que mostraban péptidos con afinidad a LF. El ADN de 380 fagos se aisló y el fragmento clonado fue amplificado por la técnica de PCR. El tamaño de los fragmentos varió entre 400 y 1000 pares de bases. El análisis in silico de 161 fragmentos secuenciados se llevó a cabo para buscar secuencias homólogas en los péptidos e identificar la posible identidad de los péptidos aislados, utilizando las bases de datos disponibles. Algunas de las secuencias de péptidos preliminarmente codificaron para quinasas, proteínas relacionadas a fosforilación, tafazzina y ferritina. Además, se realizaron pruebas de especificidad a diferentes concentraciones de la toxina, y otros sustratos como albúmina de suero bovino, ribonucleasa y lisozima. Los resultados sugieren que los péptidos fueron reconocidos y vinculados única y exclusivamente a LF. Finalmente, los péptidos aislados durante esta investigación, que presentaron afinidad con la toxina, servirán como base de referencia para entender nuevos mecanismos de acción e interacciones relacionadas a la patogenicidad del organismo. Esto permitará el desarrollo de biomarcadores y agentes bloqueadores de la acción de la toxina del ántrax, que pueden ser utilizados como prototipos para nuevas vacunas.