Polymeric nanocarriers for the enhancement of enzyme replacement therapy in lysosomal storage diseases: A proof of concept study

Abstract

Lysosomal Storage Diseases (LSDs) are a group of inheritable genetic diseases caused by mutant lysosomal enzymes, leading to the accumulation of undigested macromolecules in the lysosomes and causing increases in lysosome size and number, cellular dysfunction, clinical abnormalities and premature death. These LSDs can be treated with Enzyme Replacement Therapy (ERT) through intravenous administration of a recombinant enzyme in replacement of the defective enzyme. However, this is an expensive and inefficient method with adverse side effects associated with the high enzyme amounts required for the treatment, the need of posttranslational modification of the enzyme and the host immune system response. Nanoparticle drug delivery systems (DDSs) are a promising alternative to enclose the therapeutic cargo, then overcoming the drawbacks associated with ERT. As building blocks of those DDSs, biodegradable synthetic polymers are considered an attractive alternative for protein delivery applications because they can be designed to obtain desirable properties like low immune response, stimuli response, specific circulation time and affinity to certain drugs and environments. This research project aims to develop biodegradable and bioresponsive polymersomes, composed of amphiphilic block copolymers of Polyethylene glycol and Polycaprolactone (PEGPCL), suitable for the encapsulation and delivery of protein therapeutics as proof of concept for ERT applications. This goal was achieved through the synthesis and optimization of protein loaded polymersomes using a Water in-Oil-in Water (WOW) double emulsion method, and the addition of a protein corona composed of Fetal Bovine Serum (FBS) components. First, a group of copolymers were synthesized by Ring Opening Polymerization, using either Stannous Octoate (SO) or Hydrochloric Acid (HCl) as catalysts. Characterization was carried out by Proton Nuclear Magnetic Resonance (1H-NMR) and Gel Permeation Chromatography (GPC). Results demonstrated that SO was a better catalyst for achieving the synthesis of block copolymers of the desired molecular weight. This catalyst was used to synthesize the copolymers used in the formation of bioresponsive polymersomes. The second part of the project was to prepare a series of Water-in-Oil in Water (WOW) emulsion formulations by varying copolymer molecular weight, solvent evaporation pressure, copolymer: stabilizer ratio, emulsification technique and protein concentration in the aqueous core. The in vitro performance of the polymersomes was assessed in order to obtain ideal properties in terms of behavior under biologically relevant buffers, size, encapsulation efficiency and protein release profile. The optimal formulation consisted of using PEG–PCL with a molecular weight of the polymeric chain of 2000g/mol and 5000g/mol, respectively (PEG2000-PCL5000); a ratio of 1:1 of PEG–PCL:PVA, and reduced pressure (generated by a vacuum pump) for solvent evaporation to generate the desired polymersomes through the WOW emulsion method. In the aqueous core, the addition of model protein with a concentration of 10mg/mL (compared to concentrations of 25 and 50 mg/mL) gave the best entrapment efficiency. These polymersomes were found to be nontoxic at concentrations of up to 2mg/mL. A protein corona was added to the polymersomes to further fine-tune the desired protein release behavior. This led to the formulation of a system that completely suppresses protein release in physiological conditions (Phosphate Buffer Saline Solution, PBS, pH 7.4) and shows sustained release in acidic lysosomal environment (Artificial Lysosomal Fluid, ALF, pH 4.5). The size of these particles was determined to be theoretically appropriate for cellular internalization through measurement by Dynamic Light Scattering techniques (221 ± 21 nm in PBS and 190 ± 66 nm in ALF). We conclude that we have developed a system that warrants further investigation for the development of polymeric nanocarriers that are suitable for the enhancement of Enzyme Replacement Therapy for the treatment of Lysosomal Storage Diseases.

Las Enfermedades del Almacenamiento en el Lisosoma (EAL) corresponden a un grupo de enfermedades genéticas hereditarias causadas por enzimas mutantes en los lisosomas. Eso provoca la acumulación de macromoléculas sin degradar en los lisosomas, causando efectos adversos en la célula como aumento en el tamaño y la cantidad de lisosomas, disfunción celular, anormalidades clínicas y muerte prematura. Estas EAL pueden tratarse con Terapia de Reemplazo Enzimático (TRE), a través de infusiones intravenosas de una enzima recombinante, la cual reemplaza la enzima defectiva en el paciente. Sin embargo, estos tratamientos son ineficientes, costosos y acarrean una serie de efectos adversos relacionados a las altas dosis requeridas para que sea efectivo, el hecho de que las enzimas recombinantes necesitan modificaciones post-translacionales y la posibilidad de respuesta inmunológica adversa por parte del paciente. Sistemas de administración de fármacos (SAFs) utilizando nanopartículas son una alternativa prometedora para encapsular agentes terapéuticos de EAL, superando así las desventajas asociadas a las TRE. Como materia prima para estos SAFs, los polímeros sintéticos biocompatibles son considerados una alternativa atractiva para administración de proteínas terapéuticas porque estos pueden ser diseñados para obtener ciertas propiedades específicas como baja respuesta inmunológica, respuesta a estímulos como temperatura o pH, tiempos de circulación específicos y afinidad a ciertas drogas o ambientes. Este proyecto de investigación busca desarrollar polimerisomas biodegradables y bioresponsivos, compuestos de copolímeros anfifílicos de bloque de Poliglicol de etileno y Policaprolactona (PGE-PCL), apropiados para la encapsulación y administración de proteínas terapéuticas como prueba de concepto para aplicaciones en TREs. Esto se logró sintetizando y optimizando polimerisomas cargados de proteína, preparados usando el método de dobles emulsiones con la metodológica conocida como “Agua – en Aceite – en Agua” (AAA) y la adición de una corona de proteínas en la superficie de la nanopartícula, utilizando componentes del Suero Fetal Bovino (SFB). Primeramente, se sintetizó un grupo de copolímeros con la técnica de Polimerización de Apertura de Anillo, utilizando Octoato de Estaño (OE) o Ácido Hidroclorhídrico (AH) como catalizadores. La caracterización de los copolímeros se llevó a cabo utilizando Resonancia Magnética Nuclear (RMN) y Cromatografía de Permeación de Gel (CPG). Los resultados demostraron que OE era un mejor catalizador que AH porque se obtuvieron copolímeros de bloque del peso molecular deseados. Este catalizador fue utilizado para sintetizar los copolímeros utilizados en la formación de polimerisomas bioresponsivos. En la segunda parte del proyecto se prepararon diferentes formulaciones de emulsiones AAA variando el largo de las cadenas de los copolímeros, la presión del proceso de evaporación de solvente, la razón del copolímeros y su agente estabilizador, la técnica de emulsificación y la concentración de proteína modelo en el centro acuoso de las nanopartículas. El rendimiento in vitro de los polimerisomas se evaluó para obtener propiedades ideales en términos de comportamiento en amortiguadores biológicamente relevantes, tamaño hidrodinámico, eficiencia de encapsulación y perfil de liberación de la proteína modelo. La formulación óptima consistió de un copolímero de PGE-PCL con peso molecular de cadena de 2000g/mol para PGE y 5000g/mol para PCL (PGE2000-PCL5000); de una razón copolímero:estabilizador de 1:1 y de evaporación de solvente usando vacío. La concentración de 10mg/mL de proteína modelo en el centro acuoso de las nanopartículas resultó ser la candidata con mayor eficiencia de encapsulación (comparado con concentraciones de 25 y 50mg/mL). Estos polimerisomas resultaron no ser tóxicos hasta concentraciones de 2mg/mL. La corona de proteínas de suero fue añadida con el propósito de afinar el comportamiento en los ensayos de liberación de proteína en ambientes biológicamente relevantes. Esto causó la generación de un sistema que suprimió completamente la liberación de proteína a condiciones fisiológicas (Amortiguador Salino de Fosfato, ASF, pH 7.4) y mostró liberación sostenida en ambiente lisosomal ácido (Fluido Artificial de Lisosoma, FAL, pH 4.5). El tamaño de las partículas fue determinado para que cumpliera con los requisitos teóricos para internalización de nanopartículas a nivel celular, usando la técnica de Dispersión Dinámica de Luz (DDL). Los resultaros dieron que el tamaño hidrodinámico de los polimerisomas fue 221 ± 21 en ASF (pH 7.4) y 190 ± 66 en FAL (pH 4.5). Con estos hallazgos concluimos que se ha logrado obtener un sistema que permite el adelanto de investigaciones futuras para el desarrollo de nanovehículos poliméricos apropiados para el mejoramiento de la Terapia de Reemplazo Enzimático para el tratamiento de Enfermedades de Almacenamiento en el Lisosoma.