Use of crosslinked hydrogels for the control of macromolecular crystallization

Abstract

Crosslinked hydrogels in protein crystallization is an area of continuous growth. The counterdiffusion technique is a novel method for the crystallization of proteins, which entails the minimization of convection effects, resulting in high quality crystals. The three layer implementation of this technique in capillary tubes with different diameters has been accepted for the crystallization of proteins, by using a precipitating solution which diffuses through a protein chamber containing a gel matrix that controls the diffusion process. The diffusional process using such systems can be controlled but cannot be widely manipulated. The use of crosslinked hydrogels in the middle chamber can be used to control the diffusion of the precipitant and the number and size of crystals. This research focuses on the role of the crosslinked hydrogels, which control the nucleation process in the proposed protein crystallization. The effects of polymer concentration and hydrogel mesh size on protein crystal size were studied. Some key experimental details of the proposed method were: (i) to prepare pre-polymer solutions at different concentration using protein solution as the dissolvent. (ii) to employ membranes or plugs of different polymer concentrations using water as the dissolvent to control diffusion of the precipitating agent. The above solutions were exposed to a UV light source to induce polymerization. The supersaturation wave in the protein chamber was followed indirectly by recording the crystallization front advance and the crystal size and morphology along the protein chamber. The polymer and proteins used in this study were Poly-ethyleneglycol, insulin, glucose isomerase and lysozyme. The results showed that when lysozyme protein was employed, the nucleation and crystal growth could be controlled by changing the polymer composition in the plug and the protein chamber respectively. In the case of insulin and glucose isomerase it was found that it is possible to obtain crystals of previously reported morphologies by using PEG hydrogel. Mesh sizes were also measured and they varied from 10-20 Å. This research led to the conclusion that the use of crosslinked hydrogels is a potential option for macromolecular crystallization, given that diffusion control can be readily manipulated and the polymer hydrogel does not affect protein crystal quality.

El potencial de hidrogeles entrecruzados en la cristalización de proteínas es un área en continuo crecimiento. La técnica de contradifusión es un nuevo método para la cristalización de proteínas, el cual reduce los efectos convectivos generando cristales de alta calidad. El arreglo experimental de 3 capas de esta técnica en capilares con diferentes diámetros, ha sido aceptada para la cristalización de proteínas, utilizando una solución de agente precipitante la cual difunde a través de la cámara de proteína por una una matriz de gel que controla el proceso de difusión. El proceso de difusión empleando este tipo de sistemas puede ser controlado pero no puede ser manipulado fácilmente. El uso de geles entrecruzados en la zona media de la cámara puede ser empleado para controlar el proceso de difusión del agente precipitante; por tanto el número y tamaño de cristales. El objetivo principal de esta investigación es el estudio del efecto de la concentración y tamaño de poro para controlar el tamaño final de los cristales. Para realizar esto: i) diferentes soluciones de polimero fueron preparadas usando la proteína como disolvente y ii) membranas (plugs) de diferentes porcentajes de polímero fueron empleados usando agua como disolvente para controlar el proceso de difusión del agente precipitante. Ambos soluciones fueron expuestos a radiación ultravioleta para inducir polimerización. El desarrollo de la onda de supersaturación en la cámara de proteína fue seguido indirectamente registrando el avance del frente de nucleación, el tamaño y morfología a lo largo de la cámara de proteína. El proceso de cristalización se llevo a cabo empleando hidrogeles entrecruzados de Poli (etilenglicol) (PEG) y proteínas modelos como: lisozima, insulina y glucosa isomerasa. Los resultados indicaron que cuando fue empleado lisozima el proceso de nucleación y el crecimiento del cristal puede ser controlado por cambios en la composición en el plug y por la influencia del polímero en la cámara de proteína respectivamante. En el caso de insulina y glucosa isomerasa se demostró que es posible obtener cristales de estas proteínas con similar morfologías a las reportadas en la literatura con hidrogeles de PEG. También, el tamaño de poro de los diferentes plug fue medido y variaron de 10-20 Å. Esta investigación nos permite concluir que el uso de geles entrecruzados es una potencial opción para la cristalización de macromoléculas debido a que el control de la difusión puede ser fácilmente manipulado mientras que la calidad del cristal no se ve afectada.