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dc.contributor.advisorMassol-Deyá, Arturo A.
dc.contributor.authorRodríguez-Castaño, Gina P.
dc.description.abstractNitrous oxide (N2O) is produced in different microbial processes including denitrification, nitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonia (DNRA) (Kelso et al. 1999). It has been suggested that nitrification is the main source of N2O. Understanding the mechanisms that control the flux of N2O is crucial to predict and manage emissions of this powerful greenhouse gas. Amplification of genes (nosZ) coding for nitrous oxide reductases (N2ORs) from denitrifiers and N2- fixers has been obtained by PCR methods. In this thesis, we refer to these sequences as “traditional” nosZ sequences; on the other hand, the nosZ genes from microaerophilic Anaeromyxobacter spp. and Magnetospirillum spp., and other obligate anaerobic microorganisms, such as Wolinella spp., Desulfitobacterium spp and Dechloromonas spp. have not been well studied. Their primary N2OR sequences diverge from the traditional ones and therefore, different primer sets must be developed to better understand their diversity and distribution in nature. This study developed oligonucleotides for amplifying a broader range of nosZ genes to assess their diversity in soil and bioreactors by cultureindependent techniques. nosZ sequences obtained from environmental samples were different from traditional nosZ sequences. None of the clone sequences shared more than 62% amino acid similarity with traditional NosZ. Additionally, this analysis revealed the presence of conserved histidine residues essential for function of a mature N2OR protein. Through a phylogenetic analysis using Neighbor-Joining, Maximum Parsimony, Maximum Likelihood, and Bayesian Inference methods, nine clades of NosZ variants were identified. Neither of the clone sequences fell into the traditional NosZ phylogenetic clades, but grouped with Anaeromyxobacter spp., Magnetospirillum spp., Desulfitobacterium hafniense, and Dechloromonas aromatica. The detection of nosZ genes was achieved by ISRT-PCR/FISH using an internal fluorescently-labeled NosZ943 probe. This constitutes the first published report of probing nosZ amplicons inside of active microbial cells using an optimized In Situ Reverse Transcriptase-PCR/Fluorescent In Situ Hybridization (ISRT-PCR/FISH) protocol. Our results show that a clone carrying the partial Anaeromyxobacter nosZ gene emits a strong fluorescent signal when detected with NosZ943 probe, but not with Nos1527 probe; while a clone carrying the partial Pseudomonas gene did not emit any fluorescent signal with the NosZ943 probe. ISRTPCR was further applied to natural samples from an anoxic bioreactor. Approximately 4% of total cell counts were expressing the novel nosZ genes. We demonstrate the existence of many variants of nosZ gene that are not yet represented by cultured organisms. These variants could represent a high functional diversity for reducing N2O in the environment. Therefore, the diversity of nosZ genes in nature and their contribution to the N2O budget warrants further exploration.en_US
dc.description.abstractEl óxido nitroso (N2O) es producido en diferentes procesos microbianos incluyendo desnitrificación, nitrificación y reducción desasimilativa del nitrato a amonio (DNRA) (Kelso et al. 1999). La denitrificación se ha sugerido es la fuente principal de N2O (Wolf and Russow, 2000). Entender los mecanismos que controlan el flujo de N2O es crucial para predecir y tratar las emisiones de este poderoso gas de invernadero. La amplificación de los genes (nosZ) que codifican para las óxido nitroso reductasas (N2ORs) de desnitrificadores y fijadores de N2 ha sido obtenida por métodos de PCR. En esta tesis se refiere a estas secuencias como las secuencias nosZ “tradicionales”; por otro lado, los genes nosZ de microerófílos como Anaeromyxobacter spp., Magnetospirillum spp. y otros microoganismos anaerobios obligados Wolinella spp., Desulfitobacterium spp. y Dechloromonas spp. no han sido bien estudiados. La secuencia primaria de sus N2ORs diverge de las tradicionales y, por lo tanto, diferentes parejas de cebadores deben ser desarrollados para entender mejor su diversidad y distribución en la naturaleza. Este estudio desarrolló oligonucleótidos para amplificar un rango más amplio de genes nosZ para evaluar su diversidad en suelo y bioreactores por técnicas independientes de cultivo. Las secuencias nosZ obtenidas de muestras ambientales fueron diferentes de las secuencias nosZ tradicionales. Ninguna secuencia de aminoácidos de los clones compartió más del 62% de similaridad con las NosZ tradicionales. Adicionalmente, este análisis reveló la presencia de residuos de histidina conservados esenciales para el funcionamiento de la proteína N2OR madura. A través de un análisis filogenético utilizando los métodos del vecino más cercano, máxima parsimonia, máxima verosimilitud e inferencia bayesiana, nueve clados de variantes del NosZ fueron identificados. Ninguna de las secuencias de los clones se ubicó dentro de los clados de los NosZ tradicionales, pero se agruparon con Anaeromyxobacter spp., Magnetospirillum spp., Desulfitobacterium hafniense, y Dechloromonas aromatica. La detección de los genes nosZ fue lograda por ISRT-PCR/FISH usando una sonda interna NosZ943 marcada fluorescentemente. Este representa el primer informe publicado del sondaje de amplificaciones del nosZ dentro de células microbianas activas usando un protocolo optimizado de In Situ PCR de Transcripción Reversa/Hibridización In Situ Fluorescente (ISRT-PCR/FISH). Nuestros resultados muestran que un clon con la secuencia parcial del gen nosZ de Anaeromyxobacter emitía una fuerte señal fluorescente cuando era detectado con la sonda NosZ943 pero no con la sonda Nos1527; mientras que un clon con la secuencia parcial del gen nosZ de Pseudomonas no emitió ninguna señal fluorescente con la sonda NosZ943. El ISRT-PCR fue también empleado para muestras naturales de un bioreactor anóxico. Aproximadamente 4% del conteo total de células estaban expresando los genes nosZ novel. Nosotros demostramos la existencia de numerosas variantes del gen nosZ que aún no están representadas por organismos cultivables. Estas variantes pueden representar una alta diversidad funcional para reducir N2O en el ambiente. Por lo tanto, la diversidad de los genes nosZ en la naturaleza y su contribución al monto de N2O requiere más exploración.en_US
dc.subjectNitrous oxide (N2O)en_US
dc.subjectDissimilatory nitrate reductionen_US
dc.subjectGreenhouse gasen_US
dc.subject.lcshNitrous oxideen_US
dc.subject.lcshPolymerase chain reactionen_US
dc.subject.lcshPhylogeny--Molecular aspectsen_US
dc.subject.lcshTerminal restriction fragment length polymorphism analysisen_US
dc.subject.lcshHybridization--Molecular aspectsen_US
dc.titleSequence diversity and expression of novel bacterial nitrous oxide reductase (Nosz) genes in tropical environmentsen_US
dc.rights.licenseAll rights reserveden_US
dc.rights.holder(c) Gina P Rodríguez-Castañoen_US
dc.contributor.committeeLoeffler, Frank E.
dc.contributor.committeeMontalvo-Rodríguez, Rafael R.
dc.contributor.committeeMuñoz, Carlos A.
dc.contributor.representativeCorredor, Jorge E.
dc.contributor.collegeCollege of Arts and Sciences - Sciencesen_US
dc.contributor.departmentDepartment of Biologyen_US

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