Culture dependent and functional genomic analysis of bioprospects capable of producing antibacterial agents

Abstract

Regardless of new technologies, increasing availability of vaccines, and novel medicine advances, infectious diseases are one of the principal causes of human mortality. Infectious disease control has become even more difficult with the emergence of drug resistant microorganisms, including methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), vancomycin-resistant Enterococcus faecium (VRE), carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae (NDM-1), and multidrug-resistant (MDR) Pseudomonas aeruginosa. To counteract this issue, this research aims to search for cultivable antimicrobial agents producing microbes (CAAPM) from the Microbial Biotechnology and Bioprospecting Laboratory´s (MBBL) collection isolated from the Guánica Dry Forest, Guajataca Forest and Toro Negro Forest, and from the hypersaline microbial mats (MM) from Cabo Rojo’s salterns. The microbial targets included Escherichia coli (ATCC 8677), Pseudomonas aeruginosa (27853), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), and Bacillus subtilis (ATCC 6633). The MBBL’s collection and the MM were screened for antimicrobial production with a modified Kirby Bauer method and for polyketide synthase (PKS) by PCR using specific primers. One CAAPM was isolated from the MBBL’s collection and another from the MM, and named WJ and 7M respectively. Both CAAPMs produced an inhibition halo against S. aureus and B. subtilis by bioprospect direct contact and both amplified for PKS. Their 16S rDNA was amplified by PCR and analyzed with in silico tools suggesting 7M and WJ belong to Bacillus and Pseudomonas genus respectively. Macroscopic and microscopic characterization confirmed the morphology described for both genus and suggested by the in silico analysis. A 7M genomic library composed of 350 clones with 80% insert, and a WJ genomic library composed of 37,960 clones with 70% insert were constructed using the CopyControl™ Fosmid Library Production Kit using pCC1FOS™ Vector. No antimicrobial activity was detected with the overlay method, but PKS PCR amplification and in silico analysis from 7M and WJ genomic DNA and genomic libraries suggested they have PKS related genes. After extracting WJ genomic DNA by a direct method, a combinatorial chemistry Phage Display Library (PDL) was generated using the T7 Select 10-3 cloning kit (Novagen). Two different types of screening were done to the PDL. The first screening was a double layer assay, where a lawn of Escherichia coli with individual T7-Bioprospect PDL plaques were exposed to the target by pouring top agar inoculated with Staphylococcus aureus over the plaques. The second screening consisted in combining the T7-Bioprospect PDL with E. coli and S. aureus in the same top agar solution. After screening 0.0001% of the T7 PDL no positive results were detected, but a larger screening batch has to be done in order to test this technique’s full potential. While more library screening and optimization processes are in progress, this is a promising strategy to find molecules with antibiosis activity. The combination of cultivable dependent and functional genomics approaches have proved to be a challenging but strong resource to unravel antimicrobial agents from the microbial flora of different environments. The inhibition obtained from WJ and 7M could represent a possible solution against MRSA.

Independientemente de las nuevas tecnologías, la creciente disponibilidad de vacunas y los nuevos avances en la medicina, las enfermedades infecciosas son una de las principales causas de la mortalidad humana. Controlar las enfermedades infecciosas se ha vuelto aún más difícil con la aparición de microorganismos resistentes a fármacos, incluyendo Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), Enterococcus faecium resistentes a vancomicina (VRE), Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenemas (NDM-1) y Pseudomonas aeruginosa multirresistente (MDR). Para contrarrestar este problema, esta investigación tiene como objetivo la búsqueda de agentes antimicrobianos producidos por microorganismos cultivables (CAAPM) en los tapetes microbianos (MM) hipersalinos de las salinas de Cabo Rojo y de la colección microbiana del Laboratorio de Biotecnología Microbiana y Bioprospectos (MBBL) que fue generada del Bosque Seco de Guánica, Bosque Guajataca y del Bosque Toro Negro de Puerto Rico. Los microorganismos “target” fueron Escherichia coli (ATCC 8677), Pseudomonas aeruginosa (27853), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) y Bacillus subtilis (ATCC 6633). La colección del MBBL y los MMs fueron analizados para detectar la producción de agentes antimicrobianos por el método de Kirby Bauer modificado y para detectar sintetasas de polikétidos (PKS) por PCR usando cebadores específicos. Un CAAPM fue aislado de la colección del MBBL y otro de los MMs, llamados WJ y 7M respectivamente. Ambos CAAPMs produjeron un halo de inhibición contra S. aureus y B. subtilis por contacto directo y ambos amplificaron para PKS. El 16S rDNA de ambos bioprospectos se amplificó por PCR y se le realizaron análisis in silico que sugirió que 7M y WJ pertenecen al género Bacillus y al género Pseudomonas respectivamente. La caracterización macroscópica y microscópica confirmó la morfología descrita para ambos géneros sugeridos por el análisis in silico. Una biblioteca genómica de 7M compuesta de 350 clones con un 80% de insertos y una biblioteca genómica de WJ compuesta de 37,960 clones con un 70% de insertos fueron construidas utilizando el “CopyControl™ Fosmid Library Production Kit” y el vector pCC1FOS ™. No se detectó actividad antimicrobiana con el método de superposición de Top Agar, pero la amplificación de PKS por PCR y el análisis in silico del ADN genómico de 7M y WJ y de las bibliotecas genómicas sugirió que tienen genes relacionados PKS. Luego de extraer el ADN genómico de WJ por método directo, se hizo química combinatorial generando una Biblioteca de “Phage Display” (PDL) utilizando el “T7 Select 10-3 cloning kit” (Novagen). Dos pruebas de discernimiento se realizaron para la PDL. La primera era un ensayo de doble capa, en donde un césped de Escherichia coli con placas individuales de la T7-PDL de WJ se expusieron al microorganismo “target” inoculando Top Agar con Staphylococcus aureus y vertiéndolo sobre las placas. La segunda prueba de discernimiento consistía en la combinación de la T7-PDL de WJ con E. coli y S. aureus en la misma solución de Top Agar. Después de analizar el 0.0001% de la T7-PDL no se detectaron resultados positivos, pero para analizar el potencial de esta técnica, se debe realizar una prueba de discernimiento a un mayor número de placas. Aunque más procesos de discernimiento y optimización están en progreso, esta es una estrategia prometedora para encontrar moléculas con actividad antimicrobiana. La combinación de técnicas dependientes de cultivo y genómica funcional ha demostrado ser un gran recurso para estudiar agentes antimicrobianos de la flora microbiana de diferentes entornos. La inhibición obtenida de WJ y 7M podría representar una posible solución contra el MRSA.